《Horticulture Advances》：Integrative genomic resequencing and transcriptome atlas identify InDel markers for identifying tea plants resistant to anthracnose
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本研究通過全基因組重測序和轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定出與茶樹炭疽病抗性相關(guān)的特異性InDel標(biāo)記。研究人員開發(fā)了CsRc標(biāo)記，定位在Chr10染色體123,508,930 bp位點(diǎn)，能有效區(qū)分抗病（590 bp/雜合帶）與感病（431 bp）茶樹基因型，在206個(gè)品種中驗(yàn)證準(zhǔn)確率達(dá)88.59%。該標(biāo)記位于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因內(nèi)，揭示了ATP在植物免疫中的關(guān)鍵作用，為茶樹抗病育種提供了高效分子工具，顯著縮短育種周期。
茶（Camellia sinensis）作為廣受歡迎的飲品，其健康益處日益受到認(rèn)可，具有緩解心理壓力的神經(jīng)松弛作用和潛在的化學(xué)預(yù)防癌癥功效。然而，茶樹在生長過程中面臨著多種生物和非生物脅迫的挑戰(zhàn)，其中由Colletotrichum camelliae引起的炭疽病尤為嚴(yán)重，主要侵染葉片和木質(zhì)枝條，導(dǎo)致生長嚴(yán)重受阻和茶葉品質(zhì)下降。傳統(tǒng)的育種方法雖然仍是植物病理學(xué)計(jì)劃的核心，但其可擴(kuò)展性和時(shí)間限制阻礙了遺傳進(jìn)展。分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為精準(zhǔn)、高效地鑒定和選育抗病品種提供了新途徑，其中插入-缺失（InDel）標(biāo)記因其分布廣泛、密度高、變異低、多態(tài)性強(qiáng)且易于檢測，在植物抗病育種中顯示出巨大潛力。然而，關(guān)于茶樹炭疽病抗性分子標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用的報(bào)道仍然缺乏。本研究旨在填補(bǔ)這一空白，通過整合基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，開發(fā)能夠有效區(qū)分茶樹炭疽病抗/感基因型的分子標(biāo)記。
為開展此項(xiàng)研究，研究人員主要運(yùn)用了以下幾項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)方法：首先，選取抗病品種“水仙7號(hào)”（SX7）和感病品種“嶺頭單叢”（BY）作為研究材料，進(jìn)行了全基因組重測序，以鑒定全基因組范圍內(nèi)的單核苷酸多態(tài)性（SNP）和InDel變異。其次，對(duì)炭疽病菌接種5天后的葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq），分析差異表達(dá)基因（DEG），并通過京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析確定了與植物-病原體互作通路相關(guān)的基因。最后，結(jié)合重測序發(fā)現(xiàn)的InDel位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄組確定的抗病相關(guān)候選基因區(qū)間，設(shè)計(jì)并篩選了特異性InDel標(biāo)記引物，并在包含206個(gè)不同茶樹品種的群體中進(jìn)行了PCR驗(yàn)證和基因型-表型關(guān)聯(lián)分析。
基因組重測序
通過對(duì)SX7和BY進(jìn)行全基因組重測序，共鑒定出33,454,128個(gè)SNP位點(diǎn)和4,370,229個(gè)InDel標(biāo)記。分析發(fā)現(xiàn)，InDel長度分布以1-20 bp為主，其中單核苷酸InDel最為豐富。大多數(shù)InDel（83.5%）位于基因間區(qū)（INTERGENIC），而編碼序列（CDS）區(qū)域分別鑒定出11,312個(gè)（SX7）和11,393個(gè)（BY）InDel，這些變異可能導(dǎo)致基因功能改變。
轉(zhuǎn)錄組測序和差異表達(dá)基因鑒定
對(duì)接種炭疽病菌后的SX7和BY葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，共鑒定出5,001個(gè)差異表達(dá)基因（DEG），其中479個(gè)為兩品種共有。KEGG通路富集分析顯示，這些基因顯著富集于MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）信號(hào)通路、苯丙烷生物合成、類黃酮生物合成等通路，其中植物-病原體互作通路占14.84%。通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）對(duì)選定的6個(gè)植物-病原體互作通路相關(guān)基因進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)了RNA-seq數(shù)據(jù)的可靠性。
InDel標(biāo)記的篩選與驗(yàn)證
基于轉(zhuǎn)錄組KEGG分析確定的植物-病原體互作通路候選基因，研究人員從基因組重測序數(shù)據(jù)中篩選出位于這些基因內(nèi)、且長度大于50 bp的InDel多態(tài)性位點(diǎn)。從最初設(shè)計(jì)的139對(duì)InDel標(biāo)記引物中，篩選出具有多態(tài)性的引物。最終開發(fā)出的標(biāo)記CsRc，其引物序列為：CsRc-InDel-F: ACTCGGTCAAAGCAAGGCAT；CsRc-InDel-R: GACACACCAGTTTGAAATGGCA。該標(biāo)記被定位在10號(hào)染色體（Chr10）的123,508,930 bp位置。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，產(chǎn)生590 bp條帶或雜合條帶的茶樹表現(xiàn)為抗病，而產(chǎn)生431 bp條帶的則為感病。在206個(gè)不同茶樹品種中進(jìn)行驗(yàn)證，該標(biāo)記的基因型與炭疽病抗性表型的匹配率達(dá)到88.59%，證明其具有較高的準(zhǔn)確性，可用于茶樹炭疽病抗性的高通量篩選。
標(biāo)記位點(diǎn)的基因分析
CsRc分子標(biāo)記位點(diǎn)位于基因CSS0015304內(nèi)部。KEGG注釋將該基因歸類于植物-病原體互作通路，而直系同源群（KOG）數(shù)據(jù)庫注釋其為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。基因本體（GO）富集分析強(qiáng)調(diào)了其ATP結(jié)合的關(guān)鍵功能。比較轉(zhuǎn)錄組分析顯示，與ATP依賴活性相關(guān)的基因在抗病品種SX7中相較于感病品種BY顯著上調(diào)。這符合真核生物蛋白激酶（Hanks型激酶）的保守催化核心結(jié)構(gòu)，其N端賴氨酸殘基附近的甘氨酸富集基序?qū)TP結(jié)合至關(guān)重要。細(xì)胞外ATP（eATP）作為一種損傷相關(guān)分子模式（DAMP），在植物免疫中扮演重要角色。植物受損后，eATP濃度升高，與細(xì)胞表面受體（如P2K1和P2K2）結(jié)合，啟動(dòng)下游信號(hào)事件，導(dǎo)致防御相關(guān)基因的上調(diào)及防御物質(zhì)（如抗性蛋白和酚類化合物）的產(chǎn)生，從而增強(qiáng)植物的抗病性。
本研究的結(jié)論表明，通過整合抗/感炭疽病茶樹品種（SX7和BY）的全基因組重測序和接種后轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，成功鑒定并開發(fā)了一個(gè)與炭疽病抗性相關(guān)的特異性InDel標(biāo)記CsRc。該標(biāo)記能有效區(qū)分抗病與感病基因型，在206個(gè)品種中驗(yàn)證顯示出高準(zhǔn)確率，為茶樹抗炭疽病育種提供了高效的分子工具。討論部分深入闡述了分子標(biāo)記技術(shù)，特別是InDel標(biāo)記，在作物遺傳分析和育種中的廣泛應(yīng)用及優(yōu)勢。研究強(qiáng)調(diào)了ATP在植物免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的核心作用，eATP通過結(jié)合膜受體P2K1/P2K2，激活MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)等通路，調(diào)控防御基因表達(dá)，從而增強(qiáng)植物抗性。該標(biāo)記的開發(fā)不僅有助于加速抗病茶樹品種的選育進(jìn)程，縮短育種周期，也為深入理解茶樹應(yīng)對(duì)炭疽病菌侵染的分子機(jī)制提供了新的見解。研究成果發(fā)表在《Horticulture Advances》期刊上，對(duì)推動(dòng)茶樹分子育種和可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要意義。
