環烯醚萜是一類重要的植物特化代謝產物，包括閉環形式的環烯醚萜（如京尼平苷，geniposide）和開環形式的開環環烯醚萜（如馬錢子苷，loganin）。這兩種代謝路徑在早期即發生分化，其關鍵區別在于由底物特異性羧基甲基轉移酶催化的決定性甲基化步驟：分別由梔子（G. jasminoides）的GjGAMT和長春花（C. roseus）的CrLAMT催化。然而，導致它們嚴格底物特異性及進化關系的分子決定因素尚不清楚。細胞色素P450（CYP）家族，尤其是CYP72A亞家族，在開環環烯醚萜路徑中催化C-C鍵的斷裂（如secologanin合成酶，SLS），而在梔子中存在的類似CYP72A酶的功能也存疑。本研究旨在通過結構生物學、系統發育分析和生化實驗，揭示控制羧基甲基轉移酶底物特異性的結構機制，以及CYP72A酶功能分化在環烯醚萜路徑進化中的作用。

對梔子不同組織部位的分析顯示，京尼平苷、京尼平苷元（genipin）和京尼平苷-1-β-龍膽二糖苷在果實中含量最高，而京尼平酸（geniposidic acid）在上部葉片中高度積累。山梔子苷（shanzhiside）和山梔子苷甲酯（shanzhiside methylester）等也在不同組織中特異性分布。

系統發育分析表明，GjGAMT與多種LAMTs位于同一簇，擁有共同祖先節點，但形成獨立的分支，這提示它們從共同祖先演化而來，分別催化京尼平苷和馬錢子苷（loganin）的生物合成。生化實驗證實，GjGAMT僅高效催化其生理底物京尼平酸，對馬錢子酸（loganic acid）無活性；CrLAMT則相反。兩者對其他小分子羧酸或多種糖苷化環烯醚萜類似物均無活性，顯示出高度的底物專一性。

解析了GjGAMT與底物京尼平酸及輔因子產物S-腺苷高半胱氨酸（SAH）復合物的1.96 ?分辨率晶體結構。GjGAMT形成不對稱的同源二聚體：其中一個單體活性位點同時結合了SAH和京尼平酸，而另一個單體僅結合了SAH，其底物結合口袋空置，暗示了GjGAMT可能采用“半位點”催化機制。該結構包含一個SAM結合域和一個用于底物結合的α螺旋帽狀結構域。

通過結構比對，識別出GjGAMT（Phe311和Phe315）與CrLAMT（Val317和Met321）活性口袋中的關鍵差異殘基。在GjGAMT中引入F311V/F315M雙突變，使其獲得了催化馬錢子酸的活性，同時保留了其天然的京尼平酸催化活性。酶動力學分析證實了該突變體的雙重底物催化效率。相反，在CrLAMT中引入相應的V317F/M321F等突變則會削弱或改變其底物偏好。研究表明，Phe311和Phe315通過空間位阻效應協同作用，阻止馬錢子酸進入GjGAMT的活性位點，從而決定了其底物特異性。

從梔子中克隆了四個CYP72A樣基因（GjP450-1至-4）。系統發育分析顯示它們與已知的SLS等關系較近。然而，在煙草瞬時表達體系中，這四個GjP450均不能催化馬錢子苷或京尼平苷的C-C鍵斷裂反應。作為陽性對照，來自長春花的CrSLS1（CrCYP72A1）能有效催化馬錢子苷生成開環的secologanin并進一步氧化為secoxyloganin，但不能催化京尼平苷的開環反應。這表明，在梔子中，CYP72A類酶的開環活性已經喪失，這與其閉環環烯醚萜苷（如京尼平苷）的積累相符，共同驅動了與長春花開環環烯醚萜路徑的功能分化。

本研究表明，環烯醚萜與開環環烯醚萜的進化軌跡可能依賴于羧基甲基轉移酶和細胞色素P450亞家族CYP72As的功能分化。GAMT/LAMT嚴格的底物特異性以及CYP72As開環活性的喪失/保留共同驅動了遠緣物種中兩條路徑的趨異進化。結構導向的突變實驗證明，僅需少數關鍵氨基酸的替換（如GjGAMT的F311V/F315M）即可改變酶的底物特異性，支持它們源于共同祖先的假說。研究提出了環烯醚萜生物合成路徑的新分類框架：將馬錢子酸路徑定義為Ia路線，而京尼平酸/京尼平苷路徑定義為Ib路線，它們共享共同的上游中間體（如nepetalactol），與另一條產生aucubin和catalpol的路線II（基于順-順式nepetalactol）區分開來。總之，這些甲基轉移酶和CYP450的催化可塑性共同促成了高等植物化學多樣性的進化。

包括植物材料與化合物標準品的獲取、候選基因的鑒定與克隆、系統發育分析、GjGAMT及其變體的表達與純化、酶活測定與穩態動力學分析、晶體培養與結構解析、定點突變與相對活性測定、煙草瞬時表達以及代謝物HPLC分析等詳細實驗流程。本研究的結構坐標已存入蛋白質數據庫（PDB code: 8WWQ）。