小麥作為全球三大主要糧食作物之一，其生產受到葉銹病的嚴重威脅。由葉銹菌（Puccinia triticina, Pt）引起的葉銹病在流行年份可導致高達40%的產量損失。因此，挖掘抗病基因、培育抗病品種是控制該病害最可持續有效的策略。MicroRNAs (miRNAs)是一類內源性的小非編碼RNA，在植物生長、發育和脅迫響應中扮演著關鍵調控角色。然而，miRNAs在小麥葉銹病抗性中的作用機制尚不清晰。本研究旨在探索響應葉銹病的miRNAs，并解析其調控網絡。

為了鑒定響應葉銹病的miRNAs，研究人員對感病小麥品種Fielder接種Pt小種THT后0小時和12小時的幼苗葉片進行了小RNA測序。通過生物信息學分析，在測序數據中鑒定出112個已知的小麥miRNAs和2個新miRNAs。在接種后表達量變化超過50%的差異表達miRNAs中，tae-miR171a在接種后顯著上調表達。RT-qPCR分析進一步證實，在Pt侵染的不同階段，tae-miR171a的表達在12小時達到峰值，約為0小時時的3倍，這與小RNA測序結果一致。組織特異性表達分析表明，tae-miR171a在多個組織中組成型表達。這些結果表明，tae-miR171a可能在小麥對葉銹菌的免疫應答中發揮作用。

為了探究miR171a在小麥葉銹病抗性中的作用，研究團隊在六倍體小麥品種Fielder中構建了miR171a過表達（miR171a-OE）和短串聯靶標模擬（STTM）介導的沉默（miR171a-STTM）株系。表型分析發現，接種THT后，與野生型（WT）對照相比，miR171a-OE植株在幼苗期12天（dpi）時產生了更多的夏孢子堆，而miR171a-STTM植株的夏孢子堆則更少。顯微分析進一步顯示，在接種后24和48小時，miR171a-OE植株中過氧化氫（H₂O₂）的積累減少，而在144小時，其菌絲長度和密度增加。這些結果表明，miR171a增強了小麥幼苗對葉銹病的感性，而抑制miR171a則通過增加活性氧（ROS）積累和限制病原菌生長來促進抗性。

為了闡明miR171a調控葉銹病抗性的機制，研究人員通過生物信息學預測和降解組測序，確認TaSCL6-1是miR171a的主要靶基因。5' RACE實驗檢測到了miR171a介導的TaSCL6-1 mRNA切割產物。此外，在miR171a-OE株系中，TaSCL6-1的表達顯著降低，而在miR171a-STTM株系中其表達升高，這表明miR171a負向調控TaSCL6-1的表達。轉錄組數據分析顯示，在Pt侵染后24小時，TaSCL6-1同源基因的表達水平下降最為顯著。RT-qPCR分析進一步證實，TaSCL6-1同源基因的表達在侵染后18至72小時顯著下調，這與miR171a的表達呈負相關。這些結果共同證實了TaSCL6-1是miR171a響應葉銹病的主要靶標。

亞細胞定位分析表明TaSCL6-A1主要定位于細胞核。作為GRAS轉錄因子家族成員，所有TaSCL6-1同源基因（A1, B1, D1）均具有轉錄激活活性。為了探究TaSCL6-1在小麥葉銹病抗性中的作用，研究團隊構建了TaSCL6-A1過表達（TaSCL6-OE）和TaSCL6-1敲除（TaSCL6-KO）的小麥株系。接種THT后，TaSCL6-OE植株在幼苗期12 dpi時顯示的夏孢子堆少于WT植株，而TaSCL6-KO植株則顯示出更多的夏孢子堆。顯微分析揭示，在接種后24和48小時，TaSCL6-OE植株中H₂O₂積累增加，并且在144小時菌絲長度和密度降低，而TaSCL6-KO植株則表現出相反的趨勢。這些結果表明TaSCL6-1正向調控小麥對葉銹病的抗性。

為了研究TaSCL6-1調控小麥葉銹病抗性的機制，研究人員對WT和TaSCL6-OE1植株在幼苗期0和24小時接種后的葉片進行了轉錄組分析。基因本體（GO）分析揭示了幾個與葉銹病響應相關的生物過程。此外，分子功能通路，包括過氧化物酶活性、葡聚糖內切-1,3-β-D-葡萄糖苷酶活性和幾丁質酶活性顯著富集。編碼過氧化物酶（PODs）、幾丁質酶（CHTs）、轉錄因子（TFs）和蛋白激酶（PKs）的防御相關基因在TaSCL6-OE1株系中與WT相比顯著上調。

其中表達上調最顯著的基因TaPOD2、TaPOD35和TaERF114被選作進一步研究對象。通過DNA親和純化測序（DAP-seq）結合基序分析，鑒定出GAA基序（GAAGAA）是TaSCL6-A1的結合基序。在這些選定基因的啟動子區域內發現了多個推定的GAA或GAA樣基序。電泳遷移率變動分析（EMSA）表明，His標記的TaSCL6-A1重組蛋白能夠在體外特異性結合含有GAA基序的啟動子序列。通過雙熒光素酶報告系統在本氏煙草葉片中進行瞬時表達實驗證實，共表達TaSCL6-1和熒光素酶（LUC）報告基因能使報告基因活性增加約2倍，表明TaSCL6-1激活了下游基因的轉錄。

為了進一步確認TaPOD2、TaPOD35和TaERF114在葉銹病抗性中的作用，研究人員利用大麥條紋花葉病毒誘導的基因沉默（BSMV-VIGS）技術在小麥幼苗葉片中敲低了這些基因的表達。與對照相比，沉默這三個基因中的任何一個都會導致夏孢子堆形成增加和對葉銹病的感性增強。研究還發現，與對照相比，沉默這三個基因后過氧化物酶（POD）活性顯著降低，同時H₂O₂水平下降。這些發現表明，TaSCL6-1通過促進包括PODs和TFs在內的防御相關基因的表達來正向調控小麥對葉銹病的抗性。

盡管miR171a負向調控小麥對葉銹病的抗性，但其表達在Pt侵染后顯著上調，這提示可能存在上游轉錄激活因子。研究人員推測某些負調控抗病性的轉錄因子可能在侵染過程中激活miR171a的表達。前期研究表明，miR164靶向的TaNAC21/22可作為轉錄激活因子，負向調控小麥對條銹病的抗性。利用接種Pt小種THT的Fielder小麥轉錄組數據，研究人員鑒定出六個同源的TaNAC21/22基因顯著上調。RT-qPCR分析證實，TaNAC21/22-D1的表達在12小時增加了70倍以上，與轉錄組結果一致，表明Pt誘導激活了這些轉錄因子。

NAC轉錄因子結合其靶基因啟動子區域中的CATGTG基序。研究人員在MIR171a-4B/5A/7B的啟動子區域發現了多個CATGTG基序。EMSA實驗證明，重組His-TaNAC21/22-D1蛋白能夠在體外結合含有CATGTG基序的啟動子序列。為了進一步研究TaNAC21/22-D1對MIR171a-4B/5A/7B啟動子的調控作用，研究人員在本氏煙草葉片中進行了瞬時表達實驗。共表達TaNAC21/22-D1和熒光素酶報告基因能使報告基因活性增加2-3倍。為了進一步確認TaNAC21/22-D1對小麥中miR171a表達的影響，研究人員構建了TaNAC21/22-D1過表達株系。RT-qPCR分析顯示，在這些過表達株系中，TaNAC21/22-D1和miR171a的表達水平呈正相關。這些結果共同表明，TaNAC21/22-D1是小麥中miR171a表達的正向調節因子。

為了研究TaNAC21/22在小麥葉銹病抗性中的作用，研究人員選擇了三個獨立的TaNAC21/22-D1過表達株系進行表型評估。與WT對照相比，TaNAC21/22-D1過表達植株在幼苗期12 dpi時顯示出更多的夏孢子堆形成和對葉銹病的感性增強。顯微分析顯示，在接種后24和48小時，TaNAC21/22-D1過表達植株中H₂O₂積累減少，并且在144小時菌絲長度和密度增加。這些結果表明TaNAC21/22-D1負向調控小麥對葉銹病的抗性。

在miR164的預測靶基因中，基于降解組測序數據，研究人員確認了多個TaNAC21/22同源基因是miR164的靶標。RT-qPCR分析顯示，miR164的表達在12小時降至對照水平的約50%，與升高的TaNAC21/22表達呈負相關。為了進一步闡明它們在葉銹病抗性中的功能，研究人員使用BSMV-VIGS沉默了TaNAC21/22并瞬時過表達了miR164。兩種處理都導致與對照相比夏孢子堆更少、感染面積更小，這表明miR164增強了小麥對Pt的抗性，而TaNAC21/22則抑制了這種抗性。

由于增強抗病性常因抗性-產量權衡而導致作物減產，研究人員評估了調控miR171a表達對小麥產量相關性狀的影響。WT、miR171a-OE和miR171a-STTM株系在中國農業科學院試驗田的自然條件下種植。與WT相比，miR171a-OE株系表現出株高降低以及產量相關性狀（包括分蘗數、每穗粒數和千粒重）顯著下降。相反，沉默miR171a不僅增強了幼苗抗性，還維持或改善了產量構成因素，例如增加了分蘗數。因此，下調miR171a可在不損害產量的情況下增強小麥對葉銹病的抗性。

植物miRNAs是參與多種生物過程的關鍵調控分子。小RNA測序揭示，miR171a受Pt侵染誘導，并在不同發育階段和組織中組成型表達。轉基因小麥株系的功能分析證明，miR171a負向調控葉銹病抗性。降解組測序和5' RACE證實TaSCL6-1是小麥中miR171a的主要靶基因。與miR171a-STTM株系類似，過表達TaSCL6-1導致葉銹病抗性增強。因此，miR171a-TaSCL6-1模塊是小麥葉銹病抗性的關鍵調控因子。

對WT和TaSCL6-OE1株系的比較轉錄組分析鑒定出大量差異表達的下游基因，其中與H₂O₂、多糖和幾丁質分解代謝相關的過程顯著富集。過氧化物酶（PODs）是植物中關鍵的氧化還原酶，通過催化各種氧化反應在脅迫防御中發揮核心作用。此外，多個編碼轉錄因子的基因在TaSCL6-OE1株系中與WT相比顯著上調，包括TaERF114。因此，上調的PODs（TaPOD2和TaPOD35）和TFs（TaERF114）很可能是TaSCL6-1的關鍵下游基因，共同貢獻于小麥葉銹病抗性。

先前研究表明，miR171與其他miRNAs及其靶標形成復雜的調控網絡。本研究進一步證明，miR164靶向的TaNAC21/22結合到MIR171a的啟動子區域，激活其轉錄，從而增加小麥對葉銹病的感性。因此，miR164-TaNAC21/22模塊很可能位于miR171a-TaSCL6-1模塊的上游，共同調控葉銹病抗性。

基于研究結果，研究人員提出了一個關于miR171a-TaSCL6-1調控模塊在小麥葉銹病抗性中作用的工作模型。Pt侵染后，miR164表達下降，減少了對TaNAC21/22的抑制。TaNAC21/22積累的增加增強了其與MIR171a啟動子的結合并激活其轉錄。miR171a水平的升高隨后抑制了其靶基因TaSCL6-1的轉錄。這種抑制減弱了下游抗病相關基因（包括TaPOD2、TaPOD35和TaERF114）的轉錄激活，最終導致ROS產生減少和小麥對葉銹病的感性增加。這一發現揭示了一個涉及miR164-TaNAC21/22和miR171a-TaSCL6-1模塊的相互作用網絡，共同調節小麥葉銹病抗性。

提高作物抗病性同時保持或提高產量是農業面臨的主要挑戰。本研究發現，miR171a過表達株系表現出幼苗對葉銹病抗性降低，并且在田間條件下產量相關性狀嚴重受損。相反，下調miR171a不僅改善了幼苗抗性，還維持甚至增強了產量構成因素，例如增加了分蘗能力。這些結果凸顯了沉默miR171a對于抗病性和產量潛力的雙重益處。未來，可以通過基因編輯敲除或沉默miR171a，或通過標記輔助選擇miR171a表達較低的自然等位基因變異來增強抗病性。這些策略將有助于開發兼具強大葉銹病抗性和高產的新的小麥種質。