免疫療法通過直接激活或恢復抗腫瘤免疫反應來抑制腫瘤生長、轉移和復發，已從根本上改變了臨床癌癥治療。作為一種有吸引力的免疫治療策略，癌癥疫苗旨在通過遞送腫瘤相關抗原來引發抗原特異性免疫反應。然而，這些方法的主要限制是個體免疫反應存在顯著差異，這可能會影響治療效果。相比之下，光動力增強的免疫反應提供了一種更廣泛適用的替代方案。這種方法能在光激活下有效根除腫瘤細胞，同時啟動持久的系統性免疫效應。光療與免疫療法的整合不僅能增強腫瘤免疫原性，還能提高不同患者群體的治療效果。

細菌外膜囊泡（OMVs）是革蘭氏陰性菌分泌的雙層納米結構，近年來已成為極具前景的治療性遞送載體。典型尺寸在20到200納米之間，OMVs由脂多糖（LPS）、肽聚糖、周質蛋白和其他富含病原體相關分子模式的外膜成分組成。越來越多的證據表明，OMVs可以有效募集免疫細胞，啟動抗腫瘤免疫反應，并通過將巨噬細胞重編程為促炎的M1表型來增強免疫介導的細胞毒性。與其他細胞外囊泡類似，OMVs表現出優異的生物相容性，并可以被工程化用于多功能應用。值得注意的是，作為腫瘤微環境的關鍵組成部分，細菌傾向于定植于缺氧區域，這使得OMVs通過缺氧定向趨化性具備了固有的腫瘤靶向能力。這種獨特的特性允許OMVs在保留其固有生物學功能的同時，作為小分子藥物、抗體和RNA等多種治療劑的遞送載體。因此，OMVs通過提供在缺氧實體瘤中的高效靶向、滲透和積累，為增強治療效果提供了一種有吸引力的策略。

光動力療法（PDT）是一種將藥物與特定光源結合的前沿治療方法。其機制依賴于光敏劑在光照下發生光化學反應，將氧氣轉化為高細胞毒性的活性氧，例如單線態氧（¹O₂）、超氧陰離子（O₂^•?）和羥基自由基（•OH）。由于其微創性、副作用少和協同潛力，PDT被廣泛推薦用于治療黑色素瘤和導管癌等實體瘤。然而，PDT的臨床成功高度依賴于所使用的光敏劑。傳統光敏劑通常存在水溶性差的問題，導致在生理條件下聚集，并因聚集引起淬滅（ACQ）而導致ROS產生效率下降。為了解決這個問題，唐等人引入了一類新的光敏劑，它們表現出聚集誘導發光（AIE）效應，其中聚集增強了熒光和ROS的產生，顯著提高了腫瘤殺傷效力。盡管取得了這些進展，PDT的一個主要臨床限制是對正常組織的光毒性，這是由于小有機分子對腫瘤的靶向性不足及其“始終開啟”效應造成的。因此，開發具有高效腫瘤靶向性和最小脫靶效應的新型光動力劑對于克服這些挑戰至關重要。此外，由于癌癥進展涉及多種信號通路，單一治療往往無法達到最佳治療效果。相比之下，結合多個靶點或機制可以產生超越單一治療效果總和的協同效應，同時有效對抗腫瘤耐藥性。

近年來，基于OMV的光敏劑系統已成為光動力免疫治療的有前途平臺，它們利用細菌囊泡固有的免疫刺激特性和其藥物遞送能力。然而，大多數已報道的基于OMV的PDT系統主要將OMVs用作增強腫瘤積累或免疫激活的被動載體，而光敏劑的細胞內命運和光動力損傷的時空控制在很大程度上仍未得到探索。此外，許多這些系統依賴于傳統的、含重原子的光敏劑，這些光敏劑通常存在ACQ、暗毒性和在缺氧腫瘤條件下性能受損的問題。在此，我們報告了一種機制獨特的基于OMV的光動力免疫治療平臺BDPM@OMVs，它將光敏劑分子工程、逐步亞細胞靶向和免疫微環境重編程整合到一個單一系統中。一種新型無重原子AIE光敏劑（BDPM）被合理設計，以實現高效的I型/II型雙模式ROS生成和固有的線粒體靶向性。在OMV介導的細胞內存作用后，BDPM@OMVs經歷光觸發的光化學內化，誘導溶酶體破裂和BDPM隨后向線粒體的轉位，從而實現從溶酶體到線粒體的序貫光動力放大。重要的是，除了作為遞送載體外，OMVs通過促進巨噬細胞從M2表型向M1表型復極化而積極參與抗腫瘤免疫。這種獨特的結合賦予BDPM@OMVs在缺氧條件下強大的光動力功效以及針對實體瘤的協同光動力-免疫治療活性。總之，這項工作通過強調亞細胞光動力精準性和免疫調節，而非僅僅是載體功能，為基于OMV的光敏劑系統建立了一個新的設計范式。

引入重原子是提高光敏劑ROS生成效率的常用方法。然而，這種方法通常會導致暗毒性增加和光穩定性降低，這可能對其生物學應用有害。增強分子內電荷轉移（ICT）效應是降低最高占據分子軌道-最低未占據分子軌道能隙的一種有前途的策略，從而增加系間竄越的可能性并提高ROS生成效率。氟硼二吡咯是一種強吸電子基團，可以顯著增強ICT效應。在這項工作中，我們開發了BDPM，一種具有AIE效應的新型無重原子BODIPY光敏劑。三苯胺基團類似于蝴蝶的翅膀，氟硼聯吡咯作為主體，三苯基膦作為引導分子朝向線粒體的天線。這種蝴蝶形分子由于兩個三苯胺基團的螺旋槳狀構型，顯著抑制了分子內π-π堆積的形成，有助于提高熒光亮度。BDPM是使用兩個三苯胺分子作為電子給體，氟硼二吡咯作為電子受體合成的。

所有化合物均通過電噴霧電離質譜（ESI-MS）、¹H NMR和¹³C NMR進行了全面表征（圖S21-S29）。我們系統地評估了BDPM的光譜特性。如圖所示，BDPM在PBS中的紫外吸收范圍為550–650納米，峰值吸收在600納米。BDPM的熒光發射強度在DMSO/H₂O體系中隨著水含量的增加而顯著增強了386倍，顯示出優異的AIE特性。BDPM在聚集狀態下的發射光譜覆蓋600–750納米，最大發射在648納米，處于近紅外區域，有利于生物成像應用。

BDPM的單線態氧量子產率是使用9,10-蒽二基-雙（亞甲基）二丙二酸（ABDA）在PBS中測定的。此外，我們使用DCFH-DA（用于總ROS）和DHR123（用于O₂^•?）評估了BDPM在光照下產生的ROS和超氧陰離子。BDPM在白光照射下顯示出優異的ROS生成能力，DCFH和DHR123的熒光強度分別增加了42倍和80倍，優于商業光敏劑RB（玫瑰紅）。電子順磁共振光譜進一步驗證了BDPM產生的ROS類型，使用2,2,6,6-四甲基哌啶（TEMP）作為單線態氧捕獲劑和5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）作為超氧陰離子捕獲劑。總之，BDPM是一種高效的I型和II型混合光敏劑。

為了更深入地理解光動力機制，我們使用密度泛函理論（DFT）和含時密度泛函理論計算進行了廣泛的理論計算研究，以探究BDPM的光物理和電子特性。我們首先使用B3LYP/def2-SVP泛函優化了基態結構以獲得局部最優構象。然后進行頻率計算以確認優化結構的準確性。基于優化后的幾何結構，我們使用包括B3LYP/def2-TZVP、CAM-B3LYP/def2-TZVP、PBE0/def2-TZVP和M06-2X/def2-TZVP在內的多種泛函計算了激發能，并將計算的吸收波長與實驗結果進行了比較。發現PBE0/def2-TZVP確定的激發能最接近實驗值，使我們能夠推導出該結構的T態激發能。

結果顯示BDPM的S1態和T2態之間能級差很小（ΔE(ST) = 0.05 eV），有利于系間竄越（ISC）。接下來，我們分析了激發態電子躍遷。電子-空穴分析表明，BDPM的S1態在激發時表現出混合的電荷轉移（CT）/局部激發（LE）特性。在CT態中，CT發生在三苯胺（TPA）部分到吸電子基團之間。我們進一步使用片段間電荷轉移（IFCT）分析了S1態和T2態中激發類型的比例。結果表明，BDPM從S1態到T2態的躍遷伴隨著CT特征的顯著減少和LE特征的顯著增加（ΔCT% = 47.95），這促進了ISC過程。這些發現表明，所設計的光敏劑BDPM能夠發生系間竄越，顯示出生成¹O₂的巨大潛力。

在ROS中，¹O₂具有更高的細胞毒性，使得II型PDT對腫瘤細胞具有更高的光毒性。然而，超過90%的實體瘤表現出缺氧微環境，而II型PDT的氧依賴性限制了相應光敏劑在這些腫瘤中的治療效果。相比之下，涉及生物催化氧循環的I型光響應氧依賴性較低，使得I型光敏劑在缺氧腫瘤中更有效。因此，BDPM這種無重原子但具有優異ROS生成能力的新型混合光敏劑，在治療缺氧腫瘤細胞方面顯示出巨大前景。

外膜囊泡是具有負電荷表面的雙層囊泡狀球形納米顆粒。這種脂質雙層結構不僅便于OMVs進入宿主細胞，還允許藥物在囊泡內高效負載。我們采用低能量超聲將BDPM包封到OMVs的疏水層中，實現有效負載。首先，通過超速離心法從大腸桿菌DH5α中成功分離出OMVs，通過BCA蛋白定量測定其濃度為0.72毫克/毫升。透射電子顯微鏡證實了所提取OMVs的雙層囊泡結構。隨后，利用超聲輔助納米沉淀法將BDPM高效地負載到OMVs中，形成BDPM@OMVs納米復合物。

為了評估OMVs在負載光敏劑前后是否發生變化，我們首先使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析了OMVs的蛋白質譜。在光敏劑包封后未觀察到顯著變化，證實了OMVs的免疫原性得以保留。通過透射電子顯微鏡觀察到的顆粒尺寸與動態光散射測定的平均尺寸一致，分別為33.5和43.1納米。尺寸的增加進一步支持了BDPM成功負載到OMVs中。Zeta電位測量顯示，負載BDPM后，電位從-37.3毫伏增加到-31.5毫伏。這些結果證實OMVs獨特的囊泡結構得以保留，成功制備了BDPM@OMVs雜化囊泡納米顆粒。

在成功制備OMV雜化物后，我們研究了BDPM@OMVs的光學和光動力特性。結果表明，BDPM和BDPM@OMVs的紫外吸收和熒光發射光譜是一致的。值得注意的是，與游離的BDPM相比，BDPM@OMVs表現出更高的摩爾吸光系數和熒光強度，這可能是由于封裝后聚集狀態的變化所致。使用三種不同的ROS指示劑評估了BDPM@OMVs的ROS生產效率。BDPM@OMVs產生的ROS略多于游離的BDPM。這種增加可能歸因于BDPM在OMVs內聚集狀態的改變。此外，BDPM@OMVs能夠同時產生單線態氧和超氧陰離子。電子順磁共振光譜進一步證實了產生的ROS類型。值得注意的是，無論BDPM是否被封裝在OMVs中，BDPM@OMVs都表現出比RB更高的ROS生成效率。

由于OMVs的雙層囊泡結構，它們可以通過膜融合和內存作用兩種方式輕松進入腫瘤細胞。BDPM的持久熒光使其能夠追蹤OMVs被腫瘤細胞的內吞情況。為了確認BDPM@OMVs在體外被腫瘤細胞內吞的能力，進行了細胞攝取實驗。如圖所示，與游離的BDPM相比，BDPM@OMVs表現出更快速、更高效的內化到腫瘤細胞中。此外，BDPM的正電荷使其在細胞內釋放后能夠特異性染色活細胞的線粒體。作為納米級載體，OMVs在細胞攝取后被運輸到溶酶體中。通過光激活產生足夠的ROS后，溶酶體膜的通透性發生改變，釋放出BDPM和OMVs，這一過程被稱為光化學內化。

為了驗證這一細胞攝取和內化過程，在活細胞中進行了細胞器共定位實驗。結果表明，與BDPM@OMVs孵育30分鐘的MDA-MB-231細胞中，BDPM的紅色熒光與溶酶體的綠色熒光高度共定位，表明BDPM@OMVs主要定位于溶酶體中。在620納米激光照射3分鐘后，綠色和紅色熒光都從聚集狀態轉變為彌散狀態，細胞似乎發生膨脹，共定位系數下降。同時，線粒體綠色熒光和BDPM紅色熒光的共定位系數在光照前后從0.30增加到0.82。這些結果表明，BDPM@OMVs在細胞攝取后首先進入溶酶體，在光激活后，BDPM從溶酶體逃逸并定位于線粒體。BDPM表現出優異的線粒體靶向能力。這一創新設計不僅有利于多細胞器損傷，還能防止OMVs進入溶酶體后被細胞酶消化降解，從而協同增強光動力和免疫治療的療效。

BDPM@OMVs顯著的光動力活性促使我們探索在共孵育期間，由BDPM@OMVs產生的ROS是否能有效滅活癌細胞。三陰性乳腺癌是一種對常規免疫治療反應差的“冷”腫瘤，是最具侵襲性和危險的乳腺癌類型。因此，在常氧和缺氧條件下，將BDPM或BDPM@OMVs與三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231共培養，然后用白光照射30分鐘。使用MTT分析評估細胞活力。結果表明，在黑暗條件下，BDPM和BDPM@OMVs對細胞均無明顯毒性。然而，在白光照射后，當BDPM@OMVs的濃度超過6微摩爾時，細胞活力降低了80%。即使在缺氧條件下，BDPM和BDPM@OMVs也顯示出根除MDA-MB-231細胞的能力，這可能是由于I型光動力治療的氧依賴性較低所致。此外，BDPM@OMVs在消除小鼠來源的乳腺癌細胞系4T1方面也顯示出高光滅活效率。

通過熒光成像進一步評估了BDPM@OMVs對MDA-MB-231細胞的光毒性。將BDPM@OMVs與MDA-MB-231細胞共培養30分鐘，然后暴露于白光照射30分鐘。隨后，使用LIVE/DEAD?細胞成像試劑盒對培養的細胞進行染色。與MTT結果一致，大多數MDA-MB-231細胞被碘化丙啶（PI）染色，表明細胞膜被破壞，細胞已經死亡。相比之下，在黑暗條件下，MDA-MB-231細胞主要被鈣黃綠素-AM（CAM）染色，表明BDPM@OMVs的暗毒性較低。即使在缺氧條件下，相同濃度的BDPM@OMVs也消滅了大多數癌細胞，只有少數存活。這些結果表明，BDPM@OMVs不僅被癌細胞有效攝取，而且在光激活條件下也能被高效清除。

為了進一步驗證BDPM@OMVs在被癌細胞攝取后仍能被光激活產生ROS，我們使用各種光學探針檢測了在BDPM@OMVs存在下，MDA-MB-231細胞中ROS的類型和水平。使用DCFH-DA評估了細胞內總ROS含量，結果表明，在常氧和缺氧條件下，BDPM@OMVs在MDA-MB-231細胞中被有效光激活以產生大量ROS。在添加單線態氧淬滅劑疊氮化鈉后，綠色熒光信號減弱甚至消失。

隨后，使用DHR123研究了細胞內超氧陰離子的產生，熒光成像顯示，在常氧和缺氧條件下，BDPM@OMVs均顯著增加了細胞內線粒體超氧陰離子的水平。在添加超氧陰離子淬滅劑L-抗壞血酸（Vc）后，熒光也被淬滅。這些結果進一步證實，BDPM@OMVs可以被光激活以產生單線態氧和超氧陰離子。即使在缺氧條件下，BDPM@OMVs也能通過光化學過程提高細胞內ROS水平，從而有效根除癌細胞。

上述實驗數據表明，BDPM@OMVs是一種有效的根除腫瘤細胞的PDT制劑。為了進一步闡明BDPM@OMVs的詳細治療機制，我們評估了MDA-MB-231細胞的死亡模式。細胞凋亡是PDT誘導的最常見的細胞死亡形式。一旦線粒體受損，它們就會失去膜電位，從而觸發細胞凋亡。考慮到BDPM的線粒體靶向性，使用JC-1檢測了線粒體膜電位（MMP）的變化。對照組和黑暗組的MDA-MB-231細胞顯示出強烈的紅色熒光，表明MMP值很高。相比之下，BDPM和BDPM@OMVs在白光照射后導致MMP下降，這通過增強的綠色熒光反映出來，這與線粒體功能障礙相關，并與細胞毒性測定結果相符。

此外，我們使用膜聯蛋白V-FITC和PI的雙重熒光檢查了細胞凋亡，其中FITC的綠色熒光指示細胞凋亡，PI的紅色熒光標記細胞死亡。如圖所示，對照組和黑暗組沒有觀察到明顯的紅色或綠色熒光。相比之下，經BDPM和BDPM@OMVs處理的細胞在照射后顯示出增強的綠色和紅色熒光。一些凋亡細胞僅被FITC標記，表明它們正在發生凋亡。

OMVs是有效的免疫調節劑，因此，通過光內化釋放的OMVs有望與巨噬細胞相互作用并發揮免疫調節作用。這通過檢查巨噬細胞的復極化來研究。在腫瘤微環境中，M2型巨噬細胞占主導地位，并分泌抗炎因子如IL-10和TGF-β，從而抑制免疫反應。相比之下，M1型巨噬細胞通過分泌TNF-α和IL-1β主動促進免疫反應。在形態上，M2型巨噬細胞通常呈現橢圓形、煎蛋狀，而M1型巨噬細胞則呈現煎蛋狀和紡錘形的混合形態。我們使用IL-4成功誘導RAW264.7巨噬細胞極化為M2型，呈現煎蛋狀。在與脂多糖（LPS）（一種M1型巨噬細胞誘導劑）和BDPM@OMVs共孵育后，M2型巨噬細胞的形態發生改變，一些細胞伸出偽足。這些結果表明，BDPM@OMVs中存在的LPS可能有效地促進M2巨噬細胞向M1表型的轉變。

為了進一步驗證M1巨噬細胞的產生，使用ELISA試劑盒測量了細胞外細胞因子TNF-α和IL-1β。結果表明，單一分子BDPM不能刺激RAW264.7細胞的極化。相比之下，OMVs和BDPM@OMVs，與LPS類似，有效地促進了極化并上調了M1巨噬細胞中促炎細胞因子TNF-α和IL-1β的分泌。為了證實這些發現，通過流式細胞術分析了M1巨噬細胞中常見表達的標志物CD86的表達。流式細胞術結果顯示，OMVs組和BDPM@OMVs組均顯示出顯著的PE熒光信號。總之，這些實驗結果表明OMVs具有促進M2巨噬細胞向M1巨噬細胞復極化的潛力，從而通過調節免疫抑制的腫瘤微環境來增強免疫治療。

使用4T1小鼠乳腺癌模型進一步評估了OMVs對腫瘤的靶向和治療效果。通過將4T1小鼠乳腺癌細胞系接種到BALB/c小鼠體內，建立了皮下乳腺癌腫瘤模型。尾靜脈注射BDPM@OMVs后，使用激發/發射波長為550/660納米的IVIS成像系統評估體內熒光分布。最初，在腫瘤部位未觀察到熒光信號。然而，6小時后，腫瘤部位出現熒光信號，表明BDPM@OMVs正在積累。隨著時間的推移，腫瘤部位的熒光信號逐漸增強，在48小時達到峰值。在48和96小時對主要器官和腫瘤進行離體組織成像，結果顯示在48小時時，光敏劑在肝臟和腫瘤部位發出強熒光。到96小時，肝臟和腫瘤部位的熒光均顯著減弱。相比之下，注射BDPM的小鼠在腫瘤部位沒有顯示出明顯的熒光。這些結果表明，BDPM@OMVs有效靶向腫瘤組織，這歸功于OMVs高效的腫瘤靶向能力，并且在48小時后從主要器官代謝，從而最大限度地減少了對正常組織的毒性。

基于證明BDPM@OMVs有效靶向腫瘤組織和治療效果的數據，我們進一步研究了其在4T1荷瘤小鼠中的抗腫瘤功效。具體來說，將4T1荷瘤小鼠分為六組。尾靜脈注射后，小鼠在12小時后接受或不接受606納米光照射。治療重復一次，光照間隔為7天，所有小鼠在18天后被安樂死以收集腫瘤。結果顯示，只有BDPM@OMVs加光照組顯示出約85%的腫瘤生長抑制。在整個治療期間，所有實驗組小鼠的體重保持穩定。這些發現表明，BDPM@OMVs具有優異的生物相容性和有效的抗腫瘤活性，進一步凸顯了PDT與免疫治療相結合的優勢。

為了進一步評估BDPM@OMVs的抗腫瘤功效，我們對荷瘤小鼠分離出的腫瘤進行了一系列病理分析，包括H&E、TUNEL和Ki67染色。H&E染色顯示，在BDPM+光照、BDPM@OMVs和BDPM@OMVs+光照組中，只有少數細胞形態完整，許多細胞核呈現收縮或破裂。TUNEL染色顯示，由綠色熒光指示的凋亡細胞顯著增加。此外，Ki67染色顯示增殖腫瘤細胞的比例減少，淺棕色染色減少證明了這一點。其中，BDPM@OMVs+光照組對細胞死亡和腫瘤抑制的影響最為明顯。這些結果證實，BDPM@OMVs誘導的光免疫療法可以實現優異的抗腫瘤功效。

為了評估BDPM@OMVs的生物相容性，進行了紅細胞裂解實驗。使用PBS作為陰性對照，去離子水作為陽性對照，即使在BDPM@OMVs濃度高達200微克/毫升時，也未觀察到顯著的溶血（大于5%）。此外，對4T1荷瘤小鼠主要器官（心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟）的H&E染色未顯示明顯的病理變化。血清生化分析，包括丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、肌酐（CREA）和血尿素氮的測量，顯示數值均在正常范圍內，表明沒有明顯的肝腎毒性。最后，對L-02正常人肝細胞和RAW264.7巨噬細胞的MTT測定顯示，在測試的濃度范圍內，細胞活力均高于80%。這些發現表明，BDPM@OMVs表現出優異的生物安全性。

在這項研究中，我們開發了BDPM@OMVs，這是一種將無重原子的AIE光敏劑（BDPM）與細菌OMVs相結合的新型納米平臺。該平臺是第一個為光動力免疫治療設計的基于OMV的系統。我們的BDPM光敏劑同時具有I型和II型光動力活性，能夠在不使用重原子的情況下高效產生ROS，從而優于玫瑰紅等傳統光敏劑。BDPM@OMVs利用了PDT和免疫調節的雙重優勢。OMV載體促進了向腫瘤部位的靶向遞送，并實現了BDPM在腫瘤細胞內的可控釋放，從而導致精確的腫瘤特異性ROS生成和細胞凋亡。同時，OMVs通過促進巨噬細胞復極化來增強抗腫瘤免疫。這種協同方法在減少脫靶毒性的同時，顯著提高了治療效果。總之，BDPM@OMVs代表了一種變革性的癌癥治療策略。通過整合靶向光動力治療和免疫調節，該平臺能夠選擇性地根除腫瘤，并為推進光動力免疫治療領域開辟了新途徑。