Tenascin-X (TNXB)是一種細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，在結(jié)締組織中具有結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)作用，但其在睪丸發(fā)育和精子發(fā)生中的病理生理作用尚未明確。本研究首次發(fā)現(xiàn)TNXB與人類精子發(fā)生障礙相關(guān)：通過基于同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)(iTRAQ)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，在非梗阻性無精子癥患者的睪丸中，TNXB表達(dá)顯著下調(diào)。在小鼠中的發(fā)育譜分析顯示，隨著睪丸成熟，TNXB表達(dá)逐漸增加，并主要定位于生殖細(xì)胞。為了闡明其在精子發(fā)生中的功能，研究者利用Cre-LoxP系統(tǒng)，構(gòu)建了生殖細(xì)胞特異性敲除Tnxb基因的條件性基因敲除小鼠模型。結(jié)果顯示，Tnxb缺失導(dǎo)致睪丸尺寸減小、嚴(yán)重的生精小管退化、過度的生殖細(xì)胞丟失、精子發(fā)生受損，以及精子數(shù)量和活力下降。對敲除小鼠睪丸的轉(zhuǎn)錄組分析表明，失調(diào)的基因主要與減數(shù)分裂、生殖細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞骨架與緊密連接的組織以及細(xì)胞連接組裝相關(guān)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在敲除小鼠睪丸中，調(diào)控細(xì)胞骨架、細(xì)胞連接和細(xì)胞外基質(zhì)組織的關(guān)鍵蛋白存在錯(cuò)誤定位和表達(dá)改變。值得注意的是，TNXB被發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵成分IV型膠原存在相互作用。Tnxb的缺失導(dǎo)致支持細(xì)胞骨架與連接結(jié)構(gòu)之間的關(guān)聯(lián)異常。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)，TNXB對于維持睪丸內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞骨架和細(xì)胞連接三者之間的完整性及相互作用不可或缺，其缺陷會(huì)損害睪丸結(jié)構(gòu)并影響精子發(fā)生。

精子發(fā)生是一個(gè)高度有序且受時(shí)間調(diào)控的過程，涉及精原干細(xì)胞的增殖、分化、減數(shù)分裂并最終轉(zhuǎn)化為成熟精子。這一復(fù)雜過程發(fā)生在睪丸的生精上皮內(nèi)，依賴于發(fā)育中的生殖細(xì)胞與支持細(xì)胞之間緊密的物理和生化相互作用。這些相互作用的完整性取決于一個(gè)由細(xì)胞間連接、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和提供結(jié)構(gòu)支持與空間信號(hào)的細(xì)胞外基質(zhì)組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。其中任何一個(gè)組分的破壞都可能導(dǎo)致生精失敗和男性不育。TNXB屬于tenascin家族，是一種大型細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，以其調(diào)節(jié)膠原纖維生成、組織彈性和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的能力而聞名。然而，其在生殖生物學(xué)，特別是在睪丸中的功能，在很大程度上仍未被探索。本研究旨在通過整合臨床蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)、發(fā)育表達(dá)譜和功能性遺傳學(xué)方法，探究TNXB在男性生殖中的作用。

為篩選與生精缺陷相關(guān)的基因，研究者獲取了非梗阻性無精子癥和梗阻性無精子癥患者的睪丸活檢組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。在差異表達(dá)的蛋白中，TNXB在非梗阻性無精子癥組中的蛋白水平顯著低于對照組。小鼠發(fā)育譜分析則顯示，在野生型小鼠中，TNXB在睪丸中的表達(dá)隨年齡增長而嚴(yán)格上調(diào)，從出生后第1天到第56天呈漸進(jìn)性積累，在性成熟時(shí)達(dá)到峰值。免疫組織化學(xué)定位顯示TNXB富集在生精小管的基底外側(cè)細(xì)胞外基質(zhì)區(qū)室，其染色強(qiáng)度從新生兒的微弱到成年期小管周圍的強(qiáng)沉積逐漸增強(qiáng)。免疫熒光染色進(jìn)一步表明，睪丸中的TNXB與DDX4陽性的生殖細(xì)胞明顯共定位。

為了鑒定TNXB在生殖細(xì)胞發(fā)育中的作用，研究者利用Ddx4-Cre小鼠構(gòu)建了Tnxb條件性基因敲除小鼠。基因型鑒定和定量PCR及免疫印跡分析均證實(shí)，在敲除小鼠的睪丸中，Tnxb的mRNA和蛋白水平均顯著降低，表明Tnxb基因在生殖細(xì)胞中被成功敲除。

宏觀形態(tài)觀察顯示，與對照組相比，敲除小鼠的睪丸尺寸顯著減小，睪丸絕對重量和相對于體重的比值也顯著降低。通過計(jì)算機(jī)輔助精液分析發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠的精子濃度、總活力、前向運(yùn)動(dòng)活力以及快速和慢速前向運(yùn)動(dòng)精子的百分比均急劇下降。組織病理學(xué)檢查揭示了敲除小鼠生精小管的三種類型病變：空泡化、管腔阻塞和管腔縮窄，這些病理變化的比例在敲除睪丸中均顯著增加。細(xì)胞凋亡檢測和生殖細(xì)胞定量分析表明，敲除小鼠生精小管內(nèi)的凋亡細(xì)胞顯著增加，而DDX4陽性的生殖細(xì)胞數(shù)量顯著減少。此外，減數(shù)分裂標(biāo)記基因表達(dá)分析和SYCP3免疫染色顯示，敲除小鼠睪丸中減數(shù)分裂精母細(xì)胞積累，表明存在減數(shù)分裂阻滯。

對敲除和對照組小鼠睪丸進(jìn)行RNA測序分析，共鑒定出477個(gè)差異表達(dá)基因。基因本體富集分析顯示，這些基因顯著富集于聯(lián)會(huì)復(fù)合體、生殖細(xì)胞和精子細(xì)胞發(fā)育、精子發(fā)生、緊密連接組織、細(xì)胞粘附、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織和細(xì)胞間連接組織等生物過程。京都基因與基因組百科全書通路富集分析表明，上調(diào)基因主要參與亨廷頓病、氧化磷酸化和核糖體等通路，而下調(diào)基因則富集于細(xì)胞骨架相關(guān)通路。多個(gè)在染色質(zhì)重塑、細(xì)胞骨架穩(wěn)定性和精子發(fā)生中具有已知作用的關(guān)鍵基因表達(dá)出現(xiàn)顯著失調(diào)。

通過定量PCR和蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)一步驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，一些與細(xì)胞骨架組織和細(xì)胞粘附相關(guān)的候選基因（如Myh7、Fgfr3、Pcdh8、Vill）在敲除小鼠睪丸中的mRNA和/或蛋白水平顯著降低。免疫熒光分析證實(shí)，MYH7蛋白在敲除睪丸中的信號(hào)強(qiáng)度和空間分布均出現(xiàn)異常。

免疫熒光分析檢測了多種關(guān)鍵細(xì)胞骨架和連接蛋白的定位與表達(dá)。在敲除小鼠睪丸中，微管標(biāo)記物α-微管蛋白的規(guī)則排列被破壞；精子鞭毛標(biāo)記物乙酰化微管蛋白的信號(hào)顯著減少；緊密連接蛋白ZO-1和ZO-2的分布變得不連續(xù)且減少；粘附連接組分β-連環(huán)蛋白的分布出現(xiàn)擴(kuò)展且極性喪失；IV型膠原沿基底膜的連續(xù)性被破壞；支持細(xì)胞骨架蛋白波形蛋白的絲狀結(jié)構(gòu)變得紊亂。體內(nèi)生物素示蹤實(shí)驗(yàn)表明，敲除小鼠的血睪屏障完整性受損。蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)一步證實(shí)，ZO-1和ZO-2的蛋白水平顯著下降，而β-連環(huán)蛋白和N-鈣黏蛋白的水平升高。最后，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，TNXB與IV型膠原存在明確的相互作用。

本研究揭示了一個(gè)先前未被認(rèn)識(shí)的TNXB在調(diào)節(jié)精子發(fā)生和維持睪丸結(jié)構(gòu)中的作用。TNXB功能障礙與破壞生精上皮內(nèi)支撐生殖細(xì)胞-支持細(xì)胞相互作用的結(jié)構(gòu)框架有關(guān)。研究證實(shí)了TNXB與IV型膠原之間存在物理相互作用，這為TNXB在基底膜組織中的直接功能提供了機(jī)制性證據(jù)。考慮到基底膜、支持細(xì)胞骨架和血睪屏障完整性之間密切的功能關(guān)聯(lián)，TNXB與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的破壞很可能導(dǎo)致了觀察到的細(xì)胞骨架紊亂和連接不穩(wěn)定。綜合而言，研究結(jié)果證實(shí)了一個(gè)模型：TNXB通過維持細(xì)胞外基質(zhì)組織以及生精上皮內(nèi)協(xié)調(diào)細(xì)胞骨架排列、細(xì)胞連接完整性和血睪屏障功能所必需的結(jié)構(gòu)環(huán)境，來促進(jìn)精子發(fā)生。TNXB的破壞導(dǎo)致生殖細(xì)胞存活受損、生精過程缺陷和精子產(chǎn)量下降。這些結(jié)果揭示了TNXB在男性生殖生物學(xué)中的一個(gè)新角色，并暗示TNXB功能障礙可能對人類男性不育有貢獻(xiàn)。