蓖麻，作為一種能生產獨特蓖麻油酸的工業油料作物，其全球傳播與人類馴化的歷史長達數千年。這一過程塑造了其豐富的遺傳變異和表型分化，其中一個典型的性狀便是下胚軸的長度。下胚軸是連接幼苗子葉和胚根的莖段，其伸長能力直接決定了種子能否成功破土而出以及幼苗的抗倒伏性，并最終影響產量。然而，長期以來，關于馴化如何影響蓖麻基因組結構的研究有限，而對于包括蓖麻在內的非模式作物，其下胚軸長度變異的根本機制仍然是個謎。為什么來自非洲野生環境的蓖麻下胚軸短，而來自中國栽培種的下胚軸長？這背后是哪些基因在起作用，又是如何在漫長的馴化歷史中被“選中”的？為了解開這些謎團，由Jianjun Lu、Lianlian Hu、Wenbing Zhang、Cheng Pan、Donghai Li、Wei Fan、Jinbin Lin、Songbiao Chen、Peng Cui和Shiyou Lü組成的研究團隊，開展了一項深入的研究，相關成果發表在《Plant Physiology and Biochemistry》上。

為了回答上述問題，研究人員主要采用了以下關鍵技術方法：首先，構建了一個包含221份蓖麻材料的自然群體（其中26份為非洲野生短下胚軸材料，195份為中國栽培長下胚軸材料），并進行精確的表型測量和表皮細胞顯微觀察。其次，利用重測序數據（來自先前研究）進行了全基因組關聯分析和選擇性清除分析，采用遺傳分化指數（Fst）、核苷酸多樣性（π）和跨群體復合似然比（XP-CLR）等方法檢測馴化選擇信號。第三，選取代表性長短下胚軸材料，在其下胚軸最大伸長期，分離表皮組織進行RNA測序，分析差異表達基因。最后，通過酵母單雜交和啟動子突變實驗，對GWAS鑒定的關鍵候選基因的功能位點進行驗證。

研究人員對26份非洲野生短下胚軸材料和195份中國栽培長下胚軸材料進行了系統分析。表型統計顯示，野生蓖麻群體的平均下胚軸長度顯著短于中國栽培群體。對代表性材料‘s33’（長下胚軸）和‘Uganda’（短下胚軸）的生長動態監測發現，‘Uganda’在下胚軸7天時達到最大伸長速率，29天時停止伸長；而‘s33’在22天時達到最大速率，并持續伸長至55天，活性生長期延長了一倍。顯微鏡觀察顯示，在相同單位面積內，野生短下胚軸材料比栽培長下胚軸材料擁有更多的表皮細胞，但‘s33’的表皮細胞平均寬度和長度（50.46 μm和39.07 μm）顯著大于‘Uganda’（26.80 μm和21.01 μm）。這些結果表明，下胚軸的伸長伴隨著表皮細胞的伸長和擴展，而短下胚軸則表現為細胞更小、排列更密集。

為了剖析調控下胚軸伸長的轉錄圖譜，研究人員對‘Uganda’和‘s33’在最大下胚軸伸長期的表皮組織進行了比較轉錄組分析。共鑒定出2522個差異表達基因，其中1199個在‘Uganda’中表達被抑制，1323個被誘導。基因本體富集分析顯示，這些基因顯著富集于木葡聚糖木葡糖基轉移酶活性、對植物激素的響應、對生長素的響應以及對激素的響應等功能類別。這些差異表達基因被系統地歸類為以激素調控和細胞發育為核心的兩個功能模塊。在細胞發育相關基因中，鑒定出12個木葡聚糖內轉葡糖基酶/水解酶基因、8個擴展蛋白基因和5個纖維素合酶基因的同源基因，它們在長下胚軸材料中表達更高。在激素調控方面，鑒定出13個生長素響應因子、7個SAUR基因、6個赤霉素受體基因、3個油菜素內酯不敏感1基因和1個光敏色素互作因子7基因等同源基因，它們分別參與生長素、脫落酸、赤霉素、油菜素內酯和乙烯等激素的信號轉導。值得注意的是，轉錄組數據顯示，在長下胚軸材料中，HY5及其同源基因HYH的表達水平更高，這與HY5作為光形態建成的負調控因子的經典功能看似矛盾。研究人員推測，這可能反映了在中國栽培蓖麻的育種選擇中，可能偏愛增強了的光感知轉錄水平能力，這對于在次優光照條件下幼苗的建植至關重要。

為驗證這些差異表達基因是否在長期的栽培條件或野生自然萌發下經歷了選擇壓力，研究人員分析了野生與栽培群體的遺傳分歧時間和有效群體大小，并比較了它們的基因組選擇信號。結果表明，兩者的分歧時間可追溯到約16.25萬年前。栽培蓖麻的群體規模在大約3260年前達到最大，暗示了大規模人工栽培的開始。利用Fst、π和XP-CLR三種互補方法，研究人員在全基因組范圍內鑒定了受到馴化選擇的基因組區域。通過整合這些受選擇壓力影響的基因，發現它們的功能富集于細胞壁松弛和細胞擴展相關過程，如細胞壁組織、細胞壁修飾等。進一步的功能注釋將其中61個功能直系同源基因歸入以下主要類別：25個生長素調控相關基因、7個細胞壁松弛相關基因和4個擴展蛋白基因。有趣的是，大多數差異表達基因或其同源基因都位于表現出選擇信號的基因組區間內。例如，生長素響應基因SAUR36、ARF7、ARF8，以及細胞壁修飾基因XTH23、EXPB3等，都被檢測到處于推測的選擇壓力閾值內。這些結果表明，選擇作用靶向了控制激素驅動的細胞伸長和木葡聚糖內轉葡糖基酶介導的細胞壁松弛的基因座，從而產生了野生與栽培材料之間觀察到的下胚軸長度分化。

Fst值前10%篩選出的假定選擇區域。(C)位于由π和Fst值前10%推斷的假定選擇區域內的基因的GO富集結果。(D)由π比值前10%推斷的假定選擇區域。(E)由Fst值前10%推斷的假定選擇區域。(F)由CLR分數前5%推斷的假定選擇區域。">

為了探究下胚軸伸長的潛在遺傳機制，研究人員基于精確的下胚軸長度表型測量和高質量的單核苷酸多態性圖譜進行了GWAS分析。共鑒定出79個與下胚軸伸長相關的SNPs，其中10個位于外顯子區。基于GWAS分析結果，共確定了50個候選基因。在一個高置信度的連鎖不平衡區塊中，鑒定出15個基因，其中HY5和CESA1已被先前研究證實直接或間接與下胚軸伸長相關。在CESA1基因區域內，存在高密度的變異位點，基因型-表型關聯分析表明，攜帶GTG單倍型的材料傾向于表現出更短的下胚軸，且該基因在長下胚軸材料‘s33’中的表達水平相對更高。此外，GWAS還揭示了其他一些與細胞擴展和植物激素調控相關的基因。通過將GWAS信號與選擇性清除區域進行比對，研究人員鑒定出17個候選基因，包括HY5和CESA1，它們在控制下胚軸發育中起著關鍵作用。

通過GWAS，研究人員還鑒定出另一個特征明確的基因HY5。在HY5基因的啟動子區域鑒定出一個位于TGACG基序內的SNP。該基序是TGA家族轉錄因子的結合位點。研究人員假設該SNP通過調節TGA-HY5互作來調控下胚軸伸長。通過酵母單雜交實驗，研究人員證實了TGACG_-160是HY5啟動子中的一個關鍵順式調控元件，對于TGA1的結合至關重要，這也印證了GWAS結果的可靠性。因此，研究人員提出TGA1通過直接與TGACG_-160互作來調節HY5的表達，從而通過TGA-HY5模塊調控下胚軸伸長。此外，HY5所在的基因組區域也顯示出高于預期的π值，并且超過了CLR分數的選擇閾值，這強烈支持了選擇壓力在塑造表型性狀中起主要作用的觀點。

HY5的基因型變異和功能驗證。(A)候選基因HY5的基因結構。(B,D)栽培與野生蓖麻材料中遺傳變異的統計餅圖。(C,E)候選基因HY5兩種不同單倍型組間顯著性檢驗的箱線圖。(F)HY5啟動子區示意圖，顯示推定的TGA1結合位點及其突變版本的位置。(G)TGA1與HY5啟動子結合的酵母單雜交分析。(H)位于Rc29848支架上的GWAS信號。(I)經歷了選擇壓力的基因組區域（由π比值推斷）與GWAS峰值信號相關聯。(J)經歷了選擇壓力的基因組區域（由CLR分數推斷）與GWAS峰值信號相關聯。">

在討論與結論部分，研究人員強調了人工馴化對作物性狀形成的深遠影響。他們認為，栽培蓖麻通常被深播，短下胚軸種質在出苗方面面臨挑戰，而長下胚軸種質則具有優勢。因此，通過數千年的深播實踐，蓖麻的遺傳構成可能逐漸轉變，導致長下胚軸種質占主導地位。本研究通過整合表型組、轉錄組、基因組和進化分析，揭示了下胚軸伸長背后的多基因選擇足跡，并將TGA-HY5模塊定位為該性狀的潛在調控因子。這一框架為育種提供了全基因組靶點和表達標記，同時從進化角度揭示了光和激素信號組分如何在人類選擇下被重新連接，以重塑蓖麻的幼苗結構。總之，這項研究通過耦合高分辨率表型分析、表皮特異性轉錄組、GWAS和全基因組選擇掃描，揭示了蓖麻在數千年人類介導的馴化過程中形成的下胚軸伸長的多基因足跡。研究描繪了細胞和激素錨定的轉錄組圖譜，檢測到50個GWAS因果位點和61個可靠的選擇信號，并功能驗證了HY5啟動子中一個順式作用的TGACT基序變異通過提出的TGA-HY5模塊調控下胚軸伸長。這些發現闡明了下胚軸發育的遺傳結構和進化軌跡，新候選基因的表征為蓖麻的基礎研究和分子育種開辟了至關重要的新途徑。