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        Fvchli基因缺失會損害ABA介導的氣孔關閉機制,并增加草莓對Xanthomonas fragariae(草莓黃單胞菌)的敏感性

        《Plant Science》:Fvchli Deficiency Impairs ABA-Mediated Stomatal Closure and Enhances Susceptibility to Xanthomonas fragariae in Strawberry

        【字體: 時間:2026年02月21日 來源:Plant Science 4.1

        編輯推薦:

          鎂葉綠素原合酶亞基CHLI在草莓中通過CRISPR/Cas9編輯,發現其編輯效率與對Xanthomonas fragariae的感病性正相關,表現為ABA積累減少、氣孔關閉能力下降,促進病原菌定殖。

          
        Jingnan Luo|Jiangsong Jin|Yangyang Ma|Yanwen Jiang|Fengxue Zhu|Lanyan Zhang|Yingqiang Wen|Jiayue Feng
        中國西北農林科技大學園藝學院作物抗逆與高效生產國家重點實驗室,延安712100

        摘要

        鎂螯合酶亞基CHLI在葉綠素生物合成中的作用已經得到充分研究,但其在植物免疫中的作用尚不清楚。在本研究中,我們利用CRISPR/Cas9技術生成了嵌合的Fvchli突變草莓,并通過自交獲得了具有不同編輯效率的T1-T3代后代。編輯效率較高的突變體表現出更多的葉斑病。接種Xanthomonas fragariae后,Fvchli突變體的易感性增加,病變面積和發病率與編輯效率呈正相關。進一步實驗表明,與野生型相比,Fvchli突變體的氣孔在ABA作用下閉合速度顯著減慢。經過1.5小時的ABA處理后,野生型的氣孔開口率(寬度與長度之比)從32%降至2.3%,而編輯效率為70%的突變體氣孔開口率僅從32%降至16%。在編輯過的植物中,與ABA生物合成和信號傳導相關的基因表達水平顯著低于野生型。病原體感染后,野生型和突變體植物的ABA水平均有所升高,但Fvchli突變體的ABA水平仍顯著較低。掃描電子顯微鏡觀察發現,Fvchli突變體在感染后5小時和12小時的氣孔開口更寬,有利于細菌的廣泛定殖,而野生型植物則通過氣孔閉合有效限制了細菌入侵。

        引言

        CHLI(MgCh I亞基)是鎂螯合酶的一個亞基,負責催化Mg2?插入原卟啉IX的分子過程(Walker和Weinstein,1991;Tanaka和Tanaka,2007)。原卟啉IX是葉綠素和血紅素生物合成途徑的最后一步的共同前體。因此,鎂螯合酶是葉綠素生物合成途徑中的關鍵限速酶(Zhang等人,2021)。鎂螯合酶的另外兩個亞基是CHLD和CHLH(Jensen等人,1996)。CHLI是一個ATP酶亞基,通過ATP水解為螯合反應提供能量。其結構包含一個AAA?結構域和一個P環(核苷酸結合位點),并形成六聚體以發揮ATP水解活性(Gibson等人,1995;Reid和Hunter,2004)。CHLI的功能喪失或點突變會顯著影響葉綠素合成,導致葉片黃化或白化(Koncz等人,1990;Hansson等人,1999;Huang等人,2009;Gao等人,2016;Ma等人,2023)。脫落酸(ABA)是一種對植物生長和發育至關重要的植物激素,有助于植物適應環境挑戰(Collin和Daszkowska-Golec,2025)。Chli突變體也表現出對ABA的敏感性降低,而CHLI1基因的上調則增強了擬南芥種子萌發過程中的ABA敏感性(Du等人,2012)。在擬南芥中,CHLI敲除突變體表現出與CHLH突變體相似的ABA不敏感表型(Tsuzuki等人,2011;Tomiyama等人,2014)。
        氣孔是植物吸收CO?、釋放光合作用產生的氧氣以及通過蒸騰作用失水的主要通道(Assmann和Jegla,2016)。植物通過感知和響應環境刺激來調節氣孔開口大小,這顯著影響其生長、發育和抗逆能力(Wang和Chang,2024)。各種生物和非生物脅迫因素通過調節ABA的生物合成和信號傳導途徑來誘導氣孔閉合。干旱脅迫促進ABA生物合成,導致氣孔閉合和導度降低(Saradadevi等人,2017)。高CO?水平會誘導某些ABA受體家族成員的表達,從而促進氣孔閉合(Dittrich等人,2019)。病原體感染會觸發轉錄因子LeJA2的表達,該因子直接上調ABA生物合成基因LeNCED1,導致ABA積累增加和隨后的氣孔閉合(Du等人,2014)。Paenibacillus syringae Pst DC3000通過分泌冠菌素抑制ABA信號,促使植物重新打開氣孔,從而幫助其侵入(Liu等人,2024)。
        草莓(Fragaria × ananassa)是一種多年生常綠草本植物,作為重要的經濟水果作物在全球廣泛栽培(Hernández-Martínez等人,2023)。Xanthomonas fragariae通常引起草莓的角斑病(ALS),這是一種在許多草莓生產區普遍存在的嚴重細菌性疾病,現已成為影響草莓生產的主要問題(Wang等人,2017;Li等人,2021)。根據統計,1994年和1995年美國佛羅里達州的草莓市場產量分別下降了8.6%和7.7%,原因是角斑病(Roberts等人,1997)。2007年,在墨西哥最重要的草莓生產州米卻肯,平均發病率達到80%,造成了重大損失(Fernández-Pavía等人,2014)。2017年秋季,中國遼寧省的發病率約為5%至10%,但在一些受嚴重影響的溫室中可達到30%至40%。在中國云南省的玉溪和昆明等主要草莓生產區,2021年的平均發病率為10%至20%,嚴重受影響的地區發病率可達40%(Zhang等人,2022)。Xanthomonas fragariae于1962年首次在美國被鑒定為引起葉斑病的病原體,此后在其他地區也有發現,有時會出現新的癥狀(Li等人,2021)。Xanthomonas fragariae主要通過氣孔和傷口進入草莓葉片組織,在葉肉細胞的細胞間隙中定殖,最初受到維管束的限制,隨后導致植物細胞膜與細胞壁分離。它在細胞間隙中大量繁殖,并最終從葉片氣孔中滲出(Allan-Wojtas等人,2010)。侵入葉片后,Xanthomonas fragariae還可以沿葉柄擴散到莖部,引起莖部空洞癥狀(Wang等人,2023)。
        雖然CHLI在葉綠素生物合成中的功能已知,但其在植物抵御病原體方面的作用尚不清楚。為了解決這一空白,我們利用CRISPR/Cas9技術生成了具有不同編輯效率的Fragaria vesca Fvchli突變體。通過研究它們對Xanthomonas fragariae的易感性、氣孔動態和ABA反應,本研究旨在闡明CHLI是否通過調節ABA依賴的氣孔防御途徑在植物免疫中起關鍵作用。

        植物材料與生長條件

        實驗材料為二倍體草莓Fragaria vesca ‘Rügen’。所有植物都在控制條件下在生長室中培養:溫度25°C,光照16小時/黑暗8小時,相對濕度70%。植物種植在由土壤、蛭石和珍珠巖按3:1:1體積比配制的培養基中。

        載體構建和植物轉化

        用于序列擴增的cDNA是通過反轉錄Fragaria vesca幼葉提取的RNA獲得的

        嵌合Fvchli突變體產生具有多種編輯類型和效率的后代

        我們利用CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術生成了草莓chli突變體(圖1,A和B)。這些植物的葉片上出現了白色斑點(Ma等人,2023)。我們選擇了一株chli突變體進行自交,通過下一代測序確認其為編輯效率為15%的嵌合體,并將其命名為ΔchliT0。這產生了45株T1代后代,其中40株為編輯體,5株為野生型。觀察到了T1代中的不同編輯類型和效率

        討論

        CHLI是關鍵葉綠素生物合成酶鎂螯合酶的一個亞基,已被廣泛研究(Adams等人,2020),但其與植物抗病性的關系尚未報道。CHLI的功能喪失或點突變會顯著影響葉綠素合成,導致葉片黃化或白化(Zhao等人,2024)。我們生成的Fvchli突變體表現出白色斑點,而不是均勻的白化或黃色葉片,這可能是由于其嵌合性質所致

        結論

        總之,我們的研究表明,Fvchli的功能障礙以編輯效率依賴的方式增強了草莓對X. fragariae的敏感性。我們提供了機制證據,證明Fvchli突變導致ABA介導的氣孔閉合敏感性降低和病原體誘導的ABA積累受損。這種缺陷導致細菌感染期間氣孔開口變寬,從而促進病原體的進入和定殖。這些發現揭示了Fvchli在植物中的新功能
        作者貢獻聲明
        作者們沒有需要聲明的利益沖突。YW和JYF負責實驗設計并協調研究工作。JNL、JSJ和YYM進行了實驗。JNL撰寫了手稿。YWJ、FXZ和LYZ進行了數據分析。
        未引用的參考文獻
        (Finkelstein, 2013; Huang and Li, 2009; Chi et al., 2015)
        資助
        本研究得到了陜西省重點研發計劃(2023-YBNY-059)的支持。
        CRediT作者貢獻聲明
        Lanyan Zhang:正式分析,數據管理。Fengxue Zhu:正式分析,數據管理。Jiayue Feng:監督,項目管理,資金獲取,概念構思。Yingqiang Wen:寫作——審閱與編輯,監督,資金獲取,概念構思。Jiangsong Jin:調查,正式分析,數據管理。Jingnan Luo:寫作——初稿,方法學,數據管理。Yanwen Jiang:正式分析,數據管理。Yangyang Ma:方法學,調查
        利益沖突聲明
        作者聲明他們沒有已知的利益沖突或個人關系可能影響本文所述的工作。
        致謝
        作者感謝西北農林科技大學園藝科學研究中心的Ruihong Chen博士在場發射掃描電子顯微鏡(Hitachi SU5000)方面的專業協助。同時感謝Yangyang Yuan在共聚焦顯微鏡(LEICA TCS SP8,德國)方面的技術支持。此外,我們也感謝Jing Zhao在使用高效液相色譜-串聯質譜(Agilent 1290)進行分析方面所做的貢獻
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