《Talanta Open》：Gold nanoparticles/ZIF-8 MOFs as amplifier and few carbon nanotubes@β-cyclodextrin as carrier for sandwich-like electrochemical immunosensing of thyroid globulin
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本文為應對甲狀腺癌診斷中甲狀腺球蛋白（THY）高效、靈敏檢測的難題，報道了一種基于金納米顆粒/ZIF-8復合物（Au/ZIF）和少量碳納米管@β-環糊精（FCNTs@β-CD）的夾心式電化學免疫傳感器（SLEM）。該傳感器利用Au/ZIF固定二抗和信號探針進行信號放大，并利用FCNTs@β-CD固定一抗，實現了對THY的高靈敏檢測，線性范圍0.5–150 ng/mL，檢出限低至0.2 ng/mL，展現出優異的分析性能和應用潛力。
癌癥是威脅人類健康的全球性難題，其中甲狀腺癌在女性中的發病率位居前列。甲狀腺球蛋白（Thyroglobulin， THY）作為一種由甲狀腺濾泡細胞產生的糖蛋白，是監測甲狀腺癌患者術后復發的重要生物標志物。臨床上，血液中THY的水平是評估治療效果的關鍵指標，但傳統的檢測方法，如電化學發光、比色法、微流控技術、放射免疫分析、熒光法等，往往面臨設備復雜、成本高昂或操作耗時等挑戰。因此，開發一種快速、靈敏、簡便且經濟高效的THY檢測平臺，對于改善甲狀腺癌的診療管理具有迫切的實際意義。
本文所報道的研究成果，發表在《Talanta Open》期刊上，正是針對這一需求而開展。研究人員巧妙地設計并構建了一種高靈敏度的夾心式電化學免疫傳感（Sandwich-like Electrochemical Immunosensing， SLEM）平臺。
為了開展這項研究，研究人員主要應用了以下關鍵技術方法：首先，合成了兩種關鍵納米復合材料——金納米顆粒（Au NPs）修飾的ZIF-8金屬有機框架（Au/ZIF）作為信號放大載體，以及芘功能化的β-環糊精（Py-β-CD）修飾的少量碳納米管（FCNTs@β-CD）作為電極修飾和抗體固定載體。其次，利用差示脈沖伏安法（Differential Pulse Voltammetry， DPV）和電化學阻抗譜（Electrochemical Impedance Spectroscopy， EIS）對傳感器的組裝過程和分析性能進行表征。此外，研究還使用了掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）和傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）對納米材料的形貌與結構進行了表征。最后，通過標準添加法，利用來自當地醫院的人血清樣本，驗證了該傳感器在實際樣本分析中的準確性。
3.1. Characterization of Au/ZIF and FCNTs@β-CD
研究人員首先對所合成的納米材料進行了系統表征。通過掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）分析，觀察到ZIF-8 MOFs具有清晰的十二面體結構，邊緣長度約為80納米。在Au/ZIF納米雜化物的TEM圖像中，可以清晰看到直徑約為1.8納米的Au NPs均勻分布在ZIF-8表面，這與原始ZIF-8形成鮮明對比。電感耦合等離子體原子發射光譜（ICP-AES）進一步量化了Au的負載量為7.6 wt%，共同證實了Au NPs在ZIF-8上的成功修飾。對于FCNTs@β-CD，TEM對比分析顯示，原始FCNTs具有典型的管狀結構，直徑約為7納米，而經過β-CD功能化后，外徑增加至約8納米，表明其表面成功被修飾。傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）顯示了β-CD的特征吸收峰，證實了β-CD通過π-π堆積作用固定在FCNTs上。水分散性測試進一步驗證了雜化物的穩定性：原始FCNTs表現出嚴重的團聚和快速沉降，而FCNTs@β-CD則能形成穩定、均勻的深色分散體，這歸因于β-CD的親水性羥基降低了界面張力，防止了納米管團聚。
3.2. Fabrication of SLEM platform
為了系統地表征SLEM平臺的組裝，研究人員進行了電化學阻抗譜（EIS）測試。結果顯示，FCNTs@β-CD修飾的電極顯示出可忽略的電荷轉移電阻（Rct），而依次修飾一抗（Ab1）、THY抗原和信號放大復合物Fc-Au/ZIF-Ab2后，Rct值逐漸增加，這與生物大分子（THY和抗體）的絕緣性質一致，證實了SLEM的成功組裝。為了驗證平臺的可行性，他們采用了靈敏度更高的差示脈沖伏安法（DPV）進行分析。DPV分析顯示，在沒有THY存在的情況下，FCNTs@β-CD-Ab1修飾的電極在與Fc-Au/ZIF-Ab2孵育后沒有出現氧化還原峰；而在THY介導的夾心結構形成后，則出現了一個明顯的Fc氧化峰。用缺乏Ab1的傳感器進行的對照實驗顯示電流響應極小，驗證了特異性抗原-抗體相互作用驅動了Fc-Au/ZIF-Ab2被THY/FCNTs@β-CD-Ab1捕獲，從而確認了該SLEM平臺用于THY檢測的可行性。
接下來，為了獲得最佳的THY檢測靈敏度，研究人員系統地優化了關鍵實驗參數。包括FCNTs@β-CD分散液在電極上的滴加體積、緩沖溶液的pH值、以及THY與一抗（Ab1）和二抗（Ab2）的孵育時間。研究確定了14微升為FCNTs@β-CD的最佳負載體積，pH 7.0的磷酸鹽緩沖液（PBS）能獲得最大信號響應，THY與Ab1和Ab2的最佳孵育時間分別為20分鐘和25分鐘。
在優化的實驗條件下，研究人員全面評估了該SLEM平臺對THY的分析性能。DPV響應在0.5至150 ng/mL的THY濃度范圍內呈濃度依賴性增強，線性校準方程為y = 0.3254 + 0.19x (R2 = 0.9358)，計算出的檢測限（LOD）低至0.2 ng/mL。通過與先前報道的THY檢測方法進行比較，該SLEM方法在線性范圍和檢測限方面優于大多數現有方法，特別是電化學方法，突顯了其在痕量THY分析方面卓越的靈敏度和定量能力。
3.3. Specificity, stability, reproducibility and real samples analysis
為了驗證SLEM傳感器對THY的特異性，研究人員在優化條件下使用常見的干擾蛋白（人血清白蛋白HSA和纖維蛋白原Fbg）進行了對照實驗。通過計算特異性系數（log K），得到的log K值分別為-2.84 (HSA)和-3.65 (Fbg)，證實了干擾極小，表明SLEM傳感器對THY相對于結構相似的生物分子具有優異的選擇性。
該傳感器的長期穩定性通過在4°C下儲存24天并監測電化學響應進行評估，結果顯示信號衰減最小，證實了其在冷藏條件下具有穩健的儲存穩定性。使用10個獨立制備的傳感器評估重現性，Fc氧化還原電流測量的相對標準偏差（RSD）為4.52%。這些發現共同證明了該SLEM平臺具有出色的穩定性和制備重現性，這對于實際分析應用至關重要。
為了驗證其在真實世界中的適用性，研究人員通過標準添加法評估了該SLEM方法，使用了從當地醫院獲得的人血清樣本。將THY標準品系列稀釋后加入血清基質中，依次記錄免疫傳感器的峰值電流以計算回收率。所得回收率在90.3%至94.4%之間，證實了該方法對抗基質干擾的穩健性，展示了該SLEM平臺在復雜生物流體中準確量化THY的適用性。
綜上所述，這項研究通過整合Au/ZIF作為信號放大器和FCNTs@β-CD作為生物識別載體，開發了一種新穎、靈敏的SLEM傳感器用于THY檢測。FCNTs@β-CD納米雜化物實現了Ab1的穩定固定，而Au/ZIF則促進了Ab2的有效結合，從而形成了夾心式傳感結構。在優化參數下，該平臺實現了優異的分析性能，具有寬線性范圍（0.5–150 ng/mL）和低檢測限（0.2 ng/mL），優于大多數已報道的方法。結合優異的選擇性、24天儲存穩定性（4°C）、良好的重現性（RSD = 4.52%， n=10）以及可靠的血清樣本回收率（90.3%–94.4%），這種SLEM策略在真實樣本中進行THY定量檢測方面展現出巨大的實際應用潛力。這項研究不僅為THY的靈敏檢測提供了一種有效的新方法，也為基于納米材料復合物的高性能生物傳感器設計提供了有價值的思路。
