《Talanta》：Structure-initiated CHA variant coordinating SDA for cascade amplification in CRISPR/Cas12a-based miRNA analysis
編輯推薦：
本研究開發VCHA-SDA/Cas12a新型生物傳感平臺，通過催化發夾組裝（VCHA）與鏈置換擴增（SDA）協同作用，結合CRISPR/Cas12a實現miRNA-155高靈敏度檢測，檢測限達0.166 pmol/L，成功應用于臨床血漿及肺癌細胞系驗證。
費宇|段月|王芳婷|傅 Bowen|秦戈|魏山|臧文橋|張瓊文|崔玲玲|王濤
鄭州大學公共衛生學院，中國河南省鄭州市，450001
摘要
微小RNA（miRNA）是腫瘤診斷和監測的公認生物標志物。本文報道了一種新型生物傳感平臺，該平臺通過設計一種結構驅動的催化發夾組裝（VCHA）變體，并將其與鏈置換擴增（SDA）相結合，以實現基于CRISPR/Cas12a的級聯擴增檢測。該系統使用三種發夾探針，當它們識別到目標miRNA時，會自組裝成一個關鍵的5′端懸掛的三聯體（5′-DTC）結構。這一結構作為唯一的觸發機制，通過聚合酶和切割酶的協同作用，同時啟動VCHA循環和SDA過程。因此，VCHA和SDA在統一的電路中協同工作，生成大量的單鏈激活DNA（acDNA）產物。這些acDNA分子隨后激活CRISPR/Cas12a的切割活性，產生顯著放大的熒光信號。VCHA-SDA/Cas12a平臺在miRNA-155檢測中表現出優異的性能，檢測范圍廣泛（1 pmol/L至10 nmol/L），檢測限低至0.166 pmol/L。此外，該平臺還成功量化了臨床血漿樣本和多種細胞系中的miRNA水平，證實了其作為分子診斷和臨床應用的強大潛力。
引言
微小RNA（miRNA）是一類小型、單鏈、非編碼的RNA分子（18-24個核苷酸），可調節轉錄后基因表達[1,2]。越來越多的證據表明，體液中miRNA表達水平的異常與癌癥的發生和發展相關[3,4]，這使得miRNA定量對于疾病診斷和治療評估至關重要[5,6]。
雖然傳統的測序和RT-qPCR方法仍是臨床標準[7,8]，但它們對昂貴儀器和復雜數據分析的依賴限制了其廣泛應用[9,10]。等溫核酸擴增技術（INAATs）通過簡化的工作流程和降低成本提供了有前景的替代方案[11,12]。與PCR不同，INAATs（包括酶輔助和無酶版本）能夠在恒定溫度條件下高效擴增核酸，無需熱循環[13,14]。最近的進展產生了多種等溫擴增策略，用于核酸檢測[15]，包括滾環擴增（RCA）[16,17]、雜交鏈反應（HCR）[18,19]、催化發夾組裝（CHA）[20,21]和鏈置換擴增（SDA）[22,23]。其中，CHA因其設計靈活性和高擴增效率而脫穎而出[24]。然而，CHA的應用受到三個關鍵限制：（i）非特異性觸發導致的電路泄漏；（ii）由于嚴格的熱力學要求而帶來的設計復雜性；（iii）完全依賴熵驅動過程導致的反應動力學不佳[25]。為了解決這些問題，研究人員將CHA與其他擴增方法（如HCR、SDA、RCA）結合，開發出了改進的生物傳感平臺[26,27]。值得注意的是，SDA因其簡單的設計和協同擴增效果而成為與CHA整合的首選伙伴[28, [29], [30]]。我們的研究表明，將SDA與CHA結合可以通過協同的熵-聚合酶驅動擴增來減少電路泄漏并顯著提高檢測效率。
CRISPR/Cas系統最近徹底改變了生物傳感和診斷領域[31, [32], [33]]，其中CRISPR/Cas12a因其高特異性[34]、自我擴增能力和快速操作而特別有價值[35]。盡管許多研究已將CRISPR/Cas12a與等溫擴增技術結合以提高靈敏度[36]，但CHA-CRISPR的整合仍較少探索[37,38]。這一限制源于CHA產物主要通過雙鏈DNA（dsDNA）中間體激活Cas12a，而這些中間體需要原間隔序列（PAM）[39,40]，這限制了設計靈活性[41]。為克服這一障礙，我們提出了一種新的整合策略，利用SDA作為CHA和Cas12a之間的分子橋梁，實現高效的信號轉換和擴增。
在這項工作中，我們設計了三種發夾探針，當它們識別到miRNA155時，可以自組裝成一個5′端懸掛的三聯體（5′-DTC）。Klenow片段（KFexo-，KF）聚合酶在5′-DTC結構內沿三條路徑進行定向延伸：第一條路徑置換目標miRNA以啟動VCHA循環；另外兩條路徑生成dsDNA結構，這些結構被Nt.BbvCI切割產生雙引物。這些引物隨后結合雙功能模板，觸發多輪SDA擴增，生成大量的單鏈DNA（ssDNA）。ssDNA產物激活CRISPR/Cas12a介導的切割活性，從而產生放大的熒光信號。與傳統CHA和單擴增系統相比，我們的VCHA-SDA/Cas12a平臺具有三個顯著優勢：（1）VCHA技術解決了簡單CHA固有的泄漏問題，同時提高了靈敏度和特異性；（2）SDA將VCHA產物轉化為ssDNA，使得CRISPR/Cas12a的激活不受PAM序列限制；（3）雙引物識別模板設計提高了反應效率，縮短了處理時間。該VCHA-SDA/Cas12a系統在人血清樣本和多種肺癌細胞系中成功檢測到了miRNA155，其結果與RT-qPCR結果高度一致。這一驗證證實了其作為準確、可靠且高靈敏度生物標志物檢測平臺的實用性。
探針設計與制備
核酸探針包括三種發夾探針（H1、H2、H3）、一個雙功能模板鏈（M）以及一個熒光淬滅劑（FQ）探針。首先，H1、H2和H3被設計為在識別miRNA155后自組裝成一個復合體，通過KF聚合酶啟動VCHA循環。Nt.BbvCI切割產生的dsDNA釋放出兩個引物，這些引物與模板M結合，觸發SDA生成激活DNA（acDNA）。
VCHA-SDA/Cas12a平臺原理
為了開發一種高靈敏度和高效的檢測策略，我們設計了一種多重等溫擴增技術，將CHA的變體與SDA結合，并將其與CRISPR/Cas12a切割系統耦合以實現信號讀取。如圖1所示，使用了三種經過合理設計的發夾探針（H1、H2和H3），并優化了它們的熱力學參數以最小化非特異性雜交。當目標
結論
為了解決傳統催化發夾組裝的固有局限性，我們開發了一種新型的多重等溫擴增策略——VCHA-SDA/Cas12a系統，用于超靈敏度檢測miRNA155。該策略基于三種發夾探針的合理設計，當它們識別到目標時，會自組裝成一個5′-DTC結構。該結構隨后由KF聚合酶處理，沿著三條獨立路徑進行延伸：其中一條路徑置換目標miRNA
CRediT作者貢獻聲明
費宇：撰寫——審稿與編輯、撰寫——初稿、可視化、監督、項目管理、方法學、研究、資金獲取、數據管理、概念化。
段月：撰寫——審稿與編輯、撰寫——初稿、可視化、驗證、軟件、數據管理。
王芳婷：軟件、數據分析。
秦戈：軟件、數據分析。
魏山：軟件、數據分析。
臧文橋：
利益沖突聲明
作者聲明不存在任何可能影響本文工作的已知財務利益或個人關系。
致謝
作者衷心感謝河南省自然科學基金項目（項目編號：252300421355）、河南省科技研究項目（項目編號：242102310034和252102311168）以及鄭州大學的本科生創新與創業培訓計劃（項目編號：2025cxcy743）提供的財政支持。
