便秘，定義為每周排便少于三次，是一種常見的胃腸道疾病。它通常由結腸傳輸延長、直腸排空受損或盆底功能障礙導致，由于過度水分吸收而形成堅硬、干燥的糞便。便秘常見于神經退行性疾病如帕金森�。≒arkinson‘s disease, PD）和功能性疾病如慢性特發性便秘（chronic idiopathic constipation, CIC）。在PD中，便秘常先于運動癥狀10至20年出現。然而，多巴胺能療法和外周作用的DOPA脫羧酶抑制劑對腸道功能障礙益處甚微，這表明PD相關便秘可能涉及多巴胺能神經變性之外的機制。在CIC中，傳統的瀉藥或促動力藥無法提供持久的癥狀緩解。這些治療局限性凸顯了探索便秘背后替代機制的必要性，腸道微生物群的作用日益受到關注。

值得注意的是，嗜黏蛋白阿克曼菌（A. muciniphila）豐度的增加在不同國家的PD患者中均有報道。A. muciniphila也與糞便更硬、結腸傳輸減慢相關，并且在便秘隊列中其豐度與腸道菌群失調有關。同樣，擬桿菌屬（Bacteroides）物種在便秘患者的結腸黏膜中被報道豐度較高。這些觀察共同提出了腸道微生物組成和功能可能同時參與PD和CIC便秘的可能性。

黏蛋白是一種糖蛋白，形成結腸黏液層。它在保護腸道內襯和通過形成凝膠狀屏障來維持水分方面起著至關重要的作用。與胃和小腸不同，結腸黏蛋白攜帶末端硫酸鹽。雖然已有報道CIC患者胃黏蛋白減少，但便秘中的結腸黏蛋白水平尚未被探索。此外，腸道細菌代謝結腸黏蛋白對便秘的影響尚未在人類或動物模型中進行研究。這些觀察提出了特定微生物功能，而非單純的動力缺陷，可能是一部分患者便秘的基礎。

腸道微生物群可以通過分解黏蛋白聚糖來改變黏液結構，這可能改變黏液屏障的完整性和組成。其中，A. muciniphila和擬桿菌屬（Bacteroides spp.）是參與黏蛋白代謝的兩個主要細菌類群。然而，A. muciniphila無法降解硫酸化的結腸黏蛋白，因為它缺乏從黏蛋白寡糖上解離末端硫酸鹽所必需的硫酸酯酶。相比之下，擬桿菌屬，特別是多形擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron），作為人類糞便中擬桿菌屬的主要物種之一，擁有多功能的聚糖降解能力，包括結腸黏蛋白。值得注意的是，一些擬桿菌屬表達硫酸酯酶，這允許去除末端硫酸鹽殘基，從而促進后續的黏蛋白聚糖降解。由于脫硫酸化可能是黏蛋白降解的限速步驟，我們假設擬桿菌介導的黏蛋白脫硫酸化通過使其能夠接觸黏蛋白，從而增強了其他腸道微生物（包括A. muciniphila）的糖苷酶活性。這種協同的黏蛋白裂解可能加速黏液分解并促進便秘的發生。

本研究通過結合人類微生物群分析與無菌小鼠模型來驗證這一假設。

人類和動物研究均獲得相關倫理審查委員會的批準。參與者包括PD患者、CIC患者和健康對照。CIC患者為本研究新招募。所有CIC患者均進行了血液檢查和結腸鏡檢查以確保無任何器質性疾病，但PD患者未進行。糞便樣本在參與者家中收集并運送至實驗室。DNA從凍干糞便中提取。使用針對V3-V4高變區的引物進行16S rRNA基因測序。通過水解探針定量實時PCR（qPCR）測定細菌計數。

使用洛哌丁胺（loperamide）誘導的便秘模型在SPF野生型小鼠中建立。還建立了使用缺乏纖維的AIN93M飲食的便秘模型。通過口服灌胃單一厭氧菌培養液（OD₆₀₀≈0.7）創建無菌小鼠和限菌小鼠。通過同源重組敲除B. thetaiotaomicron中的厭氧硫酸酯酶成熟酶（anaerobic sulfatase-maturating enzyme, anSME）基因，生成ΔanSME突變株。使用糞便黏蛋白測定試劑盒定量糞便黏蛋白含量。對小鼠糞便樣本和結腸組織進行熒光染色。對小鼠結腸組織和細菌進行RNA-seq分析。使用代謝籠評估小鼠的代謝活動。通過經直腸給予FITC-葡聚糖評估腸道通透性。使用GraphPad Prism 10進行統計分析。

我們收集了231名PD患者、54名CIC患者和147名健康對照者的糞便樣本。布里斯托大便性狀量表顯示，PD和CIC患者的糞便比對照更硬。排便頻率在PD和CIC中低于對照。糞便水分含量在PD中較低，但在CIC與對照之間無顯著差異。然而，當受試者分為便秘（<每周3次排便）和非便秘亞組時，所有組中便秘亞組的糞便水分含量均顯著較低。糞便黏蛋白含量在PD中較低，但在CIC與對照之間無顯著差異。將受試者分為便秘和非便秘亞組后，PD和CIC的便秘亞組糞便黏蛋白含量顯著較低。兩因素方差分析顯示，便秘對糞便黏蛋白含量的影響顯著，而疾病（對照、PD或CIC）的影響不顯著，表明黏蛋白減少與便秘的關系比與疾病本身更密切。

通過16S rRNA測序和qPCR分析均顯示，與對照相比，CIC和PD中阿克曼菌屬（Akkermansia）豐度增加。A. muciniphila是人類糞便中阿克曼菌屬的主要且特征明確的物種。盡管最近的宏基因組分析揭示了人類糞便中存在其他阿克曼菌物種，但我們在后續分析中聚焦于A. muciniphila。將樣本按A. muciniphila豐度分為低和高兩組，高A. muciniphila的個體具有較低的水分和黏蛋白含量。同樣，在對照和PD中，便秘受試者的A. muciniphila高于非便秘受試者，但在CIC中無此差異。

我們通過qPCR定量了七種實驗證明的聚糖裂解腸道細菌的相對豐度。結果顯示，A. muciniphila和B. thetaiotaomicron在PD和CIC中均顯著增加。

因此，我們假設A. muciniphila的增加可能導致黏蛋白減少并進而導致便秘。為驗證此假設，我們建立了移植A. muciniphila的限菌小鼠模型。然而，這些限菌小鼠僅表現出輕微的便秘表型，糞便顆粒計數和糞便水分含量略有降低。這與先前一項研究結果一致，該研究顯示正常飲食下移植A. muciniphila的無菌小鼠同樣缺乏便秘。由于A. muciniphila無法降解硫酸化的結腸黏蛋白，主要覓食其他黏液聚糖（特別是胃黏蛋白），我們接下來尋找結腸黏蛋白降解細菌。文獻檢索確定了七種實驗證明能降解結腸黏蛋白的細菌。qPCR定量這七種細菌的相對豐度顯示，A. muciniphila和B. thetaiotaomicron在PD和CIC中均顯著增加。

為了評估在PD和CIC患者中觀察到的A. muciniphila和B. thetaiotaomicron增加是便秘的原因還是后果，我們在SPF野生型小鼠中使用洛哌丁胺建立了藥物誘導的便秘模型。洛哌丁胺減少了糞便輸出，確認了便秘誘導。在我們的小鼠糞便樣本中檢測到的四種聚糖裂解細菌中，B. thetaiotaomicron在洛哌丁胺治療后相對豐度顯著增加。相比之下，A. muciniphila在組水平上未表現出統計學顯著變化，盡管一些小鼠顯示出豐度增加。

為了檢查洛哌丁胺是否直接影響細菌生長，我們在存在0.0、0.1、1.0和10 μM洛哌丁胺的條件下進行了A. muciniphila和B. thetaiotaomicron的體外生長測定。洛哌丁胺抑制了A. muciniphila的生長，但不抑制B. thetaiotaomicron的生長。因此，結腸濃度可能太低而無法抑制A. muciniphila的生長。或者，洛哌丁胺抑制了生長，但未確定的便秘相關因子可能補償了這種抑制效應。

我們還使用缺乏纖維的AIN93M飲食建立了另一個便秘模型。纖維剝奪對A. muciniphila或B. thetaiotaomicron的豐度沒有影響。

在洛哌丁胺誘導和纖維剝奪便秘小鼠模型中A. muciniphila未增加，這指向一個觀點：其在PD和CIC患者中的富集不太可能是便秘的次要后果，而可能因果性地促進黏液降解和便秘的發展。

我們接下來詢問瀉藥使用是否可以解釋觀察到的細菌變化。然而，我們發現瀉藥使用依賴于疾病狀態（對照、CIC或PD），調整后的Cramer‘s V值為0.459，瀉藥無法作為評估對細菌豐度影響的獨立變量進行操作。我們另外詢問對瀉藥的反應性是否影響細菌變化。因此，我們將分析限制在使用瀉藥的CIC患者，并將他們分為無反應者（<每周3次排便）和反應者。A. muciniphila和B. thetaiotaomicron的豐度在兩組之間沒有統計學差異，表明瀉藥反應性不太可能解釋CIC患者中這些物種豐度的增加。

我們接下來通過移植A. muciniphila和B. thetaiotaomicron兩者（A.m. & B.t. 小鼠）創建了共定植小鼠，并將它們與單獨移植A. muciniphila或單獨移植B. thetaiotaomicron的單一定植小鼠進行比較。每克糞便中A. muciniphila和B. thetaiotaomicron的拷貝數在單定植和共定植小鼠之間相似，表明在所有組中定植穩定。對照限菌小鼠移植了改變的謝德勒菌群（Altered Schaedler Flora, ASF），其由八種確定的細菌組成。我們發現A.m. & B.t. 小鼠的糞便黏蛋白含量降低。盡管A.m. 小鼠的糞便黏蛋白水平低于ASF小鼠，但差異不具統計學顯著性。通過WGA、UEA1和抗Muc2抗體對糞便黏蛋白進行熒光染色進一步證實了A.m. & B.t. 小鼠糞便黏液水平降低。相比之下，A.m. 小鼠的染色與ASF對照沒有顯著差異，盡管視覺上明顯減少。

我們接下來確認，減少的糞便黏蛋白并非由于無菌小鼠結腸上皮細胞的黏蛋白產生減少。對單定植（A.m. 或B.t.）和共定植（A.m. & B.t.）小鼠結腸組織的RNA測序分析顯示，包括Muc2在內的六個黏蛋白基因、四個黏蛋白分泌基因和18個糖基轉移酶基因的表達在三組之間沒有統計學差異。此外，結腸杯狀細胞的數量和面積在三組無菌小鼠之間沒有差異。因此，共定植小鼠中糞便黏蛋白水平的降低主要歸因于細菌增強的黏蛋白降解活性。

正如預期，使用代謝籠進行的糞便分析顯示，與單定植A.m. 或B.t. 的小鼠或ASF小鼠相比，A.m. & B.t. 小鼠的糞便顆粒更少、糞便濕重更低、糞便水分含量降低。相比之下，食物攝入量、水攝入量和尿量在各組中均保持不變，這使得系統性脫水不太可能成為便秘的原因。通過經直腸給予FITC-葡聚糖（10 kDa）檢查腸道通透性。三小時后，僅在A.m & B.t. 小鼠中血漿FITC-葡聚糖水平增加，表明結腸黏液層可能變薄。因此，A. muciniphila和B. thetaiotaomicron的共移植增強了黏液覓食，導致糞便水合和潤滑減少以及腸道通透性增加，最終導致便秘。

我們接下來探討為何黏液降解在A.m. & B.t. 小鼠中增強，而在A.m. 小鼠中沒有。為此，對糞便進行RNA-seq分析，比較A.m. 和A.m. & B.t. 小鼠中A. muciniphila編碼的2354個基因的表達。正如預期，RNA-seq讀數未比對到B. thetaiotaomicron基因，因為此類基因在A.m. 小鼠中應該不存在。主成分分析顯示，在A.m. 和A.m. & B.t. 小鼠中表達的基因形成了不同的簇。使用基因本體生物過程進行超幾何檢驗的途徑分析顯示，與A.m. & B.t. 小鼠相比，硫酸鹽同化以及涉及硫的其他三個生物合成過程是A.m. 小鼠中最富集的前四個途徑。同樣，檢查A. muciniphila中與硫代謝相關的14個基因發現，與A.m. & B.t. 小鼠相比，其中6個基因在A.m. 小鼠中顯著增加。這14個基因中的12個位于KEGG數據庫中的同化硫酸鹽還原途徑及其輔助鏈烷磺酸鹽途徑中。對這些途徑中基因表達倍數變化進行顏色編碼顯示，除了ssuA和ssuC外，這些途徑中的所有基因在A.m. 小鼠中相較于A.m. & B.t. 小鼠均增加。這些途徑是細菌硫同化機制的一部分，使A. muciniphila能夠將無機或替代硫源納入生物分子。然而，重要的是要注意這些途徑在功能上不同于硫酸酯酶活性，后者是從復雜硫酸化聚糖（如結腸黏蛋白）上水解裂解硫酸鹽部分所必需的。A.m. 小鼠中硫酸鹽同化途徑增加的一種可能解釋是，硫酸鹽同化基因上調以補償硫酸鹽的缺乏�；蛘撸�在缺乏B. thetaiotaomicron的情況下硫酸鹽的缺乏可能過度刺激了宿主腸道上皮細胞為A. muciniphila提供足夠量的硫酸鹽。

我們接下來詢問硫酸酯酶是否確實是A.m. & B.t. 小鼠中降解糞便黏蛋白的關鍵。B. thetaiotaomicron中的厭氧硫酸酯酶成熟酶（anSME）對于硫酸酯酶的翻譯后活化至關重要。anSME是一種自由基S-腺苷甲硫氨酸（SAM）酶，催化半胱氨酸或絲氨酸殘基翻譯后修飾為Cα-甲酰甘氨酸。這種修飾對于激活硫酸酯酶是必需的，這使得細菌如B. thetaiotaomicron能夠降解硫酸化聚糖，包括黏蛋白O-聚糖，并將其用作營養來源。先前的報告顯示，敲除B. thetaiotaomicron中的anSME會導致硫酸酯酶活性喪失，并損害利用硫酸化多糖作為碳源的能力。因此，我們通過同源重組敲除了B. thetaiotaomicron中編碼anSME的基因。我們通過在硫酸化聚糖（硫酸軟骨素或肝素）作為唯一碳源的條件下培養它們，證實了ΔanSME菌株缺乏硫酸酯酶。正如預期，ΔanSME菌株可以在含有0.5%葡萄糖的最小培養基中生長，但不能在含有0.5%硫酸軟骨素或0.5%肝素的培養基中生長。這些結果表明anSME對于硫酸化糖胺聚糖的降解和利用是必需的。

然后，我們創建了移植A. muciniphila野生型菌株和B. thetaiotaomicron的anSME缺陷型菌株的限菌小鼠（A.m. & B.t.ΔanSME小鼠）。糞便樣本中細菌基因組拷貝數的定量顯示，ΔanSME菌株能夠定植到與野生型菌株相似的水平，表明anSME的缺失不影響B. thetaiotaomicron的定植。我們發現野生型和ΔanSME菌株之間的糞便定植水平沒有統計學顯著差異，表明ΔanSME突變體保留了與野生型菌株相當的定植能力。通過代謝籠和凍干機評估便秘發現，與A.m. & B.t. 小鼠相比，A.m. & B.t.ΔanSME小鼠的糞便顆粒計數和水分含量均增加。同樣，A.m. & B.t.ΔanSME小鼠的糞便黏蛋白含量增加，腸道通透性降低。這些結果表明，由anSME激活的硫酸酯酶對于A.m. & B.t. 小鼠中有效的黏蛋白降解是必需的。因此，B. thetaiotaomicron中功能性硫酸酯酶的缺乏導致黏液降解受損，保留了糞便水合和腸道通透性，從而保護了A.m. & B.t.ΔanSME小鼠免于發生便秘。

對PD、CIC和對照的宏基因組分析，以及對七種黏蛋白降解細菌的qPCR結果，均指出A. muciniphila和B. thetaiotaomicron是與便秘相關的候選細菌。盡管最近在阿克曼菌屬中鑒定出了其他物種，但A. muciniphila是人類腸道中的優勢物種。A. muciniphila的增加與先前報道的腸道傳輸時間慢的患者中16S rRNA測序數據一致。攜帶單獨A. muciniphila或單獨B. thetaiotaomicron的限菌小鼠未能發展出便秘。我們的A.m. 小鼠缺乏便秘與先前一項報告一致，該報告顯示攜帶A. muciniphila的無菌小鼠對腸道黏蛋白沒有影響。A. muciniphila能夠覓食具有末端唾液酸和巖藻糖殘基的黏蛋白，但不能覓食具有末端硫酸鹽的黏蛋白。由于結腸黏蛋白富含末端硫酸鹽，A. muciniphila很可能未能消化結腸黏蛋白。相比之下，同時移植兩種細菌的限菌小鼠（A.m. & B.t. 小鼠）發展出便秘。由于B. thetaiotaomicron提供硫酸酯酶以去除結腸黏蛋白的末端硫酸鹽，A. muciniphila能夠完全降解結腸黏蛋白并在A.m. & B.t. 小鼠中誘發便秘。先前一項研究顯示，移植一組由14種細菌組成的合成菌群的無菌小鼠在纖維剝奪飲食下表現出黏液層變薄。由于這14種細菌中包括了A. muciniphila和B. thetaiotaomicron，這兩種細菌很可能對黏液層變薄產生了實質性影響。

對A.m. & B.t. 和A.m. 小鼠中A. muciniphila編碼基因的糞便RNA-seq分析揭示，與A.m. & B.t. 小鼠相比，硫酸鹽同化途徑在A.m. 小鼠中上調。盡管A.m. 小鼠中上調的硫酸鹽同化途徑完全出乎意料，但我們接下來檢查了B. thetaiotaomicron中的硫酸酯酶是否確實是導致A.m. & B.t. 小鼠便秘的關鍵。因此，我們通過同源重組刪除了B. thetaiotaomicron中硫酸酯酶成熟所必需的基因anSME。正如預期，A.m. & B.t.ΔanSME小鼠與A.m. & B.t. 小鼠相比，便秘程度更輕，糞便黏蛋白含量增加，腸道通透性降低。B. thetaiotaomicron中的硫酸酯酶可能對A. muciniphila產生影響。首先，正如反復陳述的，硫酸酯酶去除結腸黏蛋白的末端硫酸鹽，使得A. muciniphila能夠覓食結腸黏蛋白。其次，硫酸酯酶為A. muciniphila提供硫酸鹽，硫酸鹽被還原為硫化物以合成L-半胱氨酸及其下游含硫分子。脫硫弧菌屬（Desulfovibrio spp.）是硫酸鹽還原菌，需要硫酸鹽進行生長，因為它們通過異化硫酸鹽還原利用硫酸鹽作為其能量代謝的末端電子受體。與A. muciniphila類似，脫硫弧菌屬依賴于其他細菌產生的硫酸鹽。有趣的是，A. muciniphila和脫硫弧菌屬在PD患者中均有增加。B. thetaiotaomicron（其在PD患者中也增加）提供充足的硫酸鹽，可能部分解釋了A. muciniphila和脫硫弧菌屬的增加。

A. muciniphila是一種黏蛋白專性細菌，能夠使用宿主來源的黏蛋白作為其唯一碳源。相比之下，硫酸酯酶并非B. thetaiotaomicron所獨有。其他細菌包括擬桿菌屬中的B. caccae和B. uniformis也能夠產生硫酸酯酶，并可以替代B. thetaiotaomicron提供硫酸酯酶。提供硫酸酯酶細菌的冗余也支持了A. muciniphila是驅動黏液消耗的關鍵細菌的觀點，盡管其完全功能需要協作細菌。

我們的研究存在以下局限性。首先，盡管CIC常先于PD發生，我們假設CIC和PD患者中有一部分具有相似的便秘細菌起源。我們確實發現A. muciniphila和B. thetaiotaomicron在CIC和PD中均增加。然而，其他未確定的細菌也可能發揮類似的便秘誘導效應。第二，對照、PD和CIC的樣本量不匹配。PD患者的大樣本量容易產生統計學顯著性，而CIC患者的小樣本量則不能。我們認為這是探索性臨床研究中普遍認識的局限性。第三，我們無法對人類樣本進行糞便黏蛋白和Muc2蛋白的免疫組化分析，因為冷凍糞便樣本未能保持微觀完整性。相反，我們量化了人類樣本中黏蛋白來源的O-聚糖，并發現在便秘患者以及A. muciniphila豐度較高的患者中，它們確實減少了。最后，雖然我們展示了A. muciniphila和B. thetaiotaomicron協同誘導結腸黏蛋白的脫硫酸化和降解并誘發便秘，但由于技術困難，我們或他人都未在便秘患者的糞便樣本中量化硫酸化聚糖和黏蛋白降解活性。然而，人類糞便樣本的鳥槍法宏基因組分析與我們的小鼠觀察結果一致。首先，在伴有快速眼動睡眠行為障礙的PD患者中，微生物CAZyme庫偏向于黏蛋白降解而非膳食纖維降解，且黏蛋白降解類群增加。第二，在大型PD患者隊列中，降解硫酸化黏蛋白聚糖的硫酸酯水解酶（KEGG Orthology: KO1138, EC 3.1.6）的基因增加。

總之，我們表明A. muciniphila是便秘發生的關鍵細菌，而另一種提供硫酸酯酶的細菌在其發展中扮演輔助但不可或缺的角色。兩種細菌協同消耗結腸黏蛋白，繼而減少水分保留和黏液潤滑。我們的研究提示人類中存在細菌性便秘。A. muciniphila的糞便豐度可作為識別此類患者的生物標志物。此外，噬菌體介導的細菌抑制或阻斷細菌硫酸酯酶的小分子可能保持結腸黏液完整性，改善糞便水合，并緩解這些患者的便秘。