《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Immune landscape in NOD.H-2h4 mouse model thyroid revealed by single-cell RNA sequencing
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本研究針對橋本氏甲狀腺炎中不同甲狀腺細胞類型的免疫失調作用不明的問題，通過對NOD.H-2h4小鼠進行單細胞RNA測序分析，構建了疾病不同階段的甲狀腺免疫微環境單細胞圖譜。研究揭示了甲狀腺濾泡細胞轉錄可塑性和Treg功能失調在疾病進展中的潛在驅動作用，為理解該疾病的細胞機制提供了寶貴數據集。
想象一下，身體的“防線”——免疫系統，某天突然調轉槍口，對生產重要“能源激素”的甲狀腺工廠發起猛攻。這就是橋本氏甲狀腺炎（Hashimoto's thyroiditis, HT），一種常見的自身免疫性疾病。患者體內淋巴細胞大量浸潤，甲狀腺濾泡細胞（thyrocytes）被無情破壞，導致永久性甲狀腺功能減退，并增加了罹患甲狀腺惡性腫瘤的臨床風險。盡管我們已對HT有所了解，但在疾病的進展過程中，甲狀腺內部究竟上演著怎樣復雜的“細胞對話”？每種細胞類型具體扮演了何種“角色”？這些關鍵細節如同籠罩在迷霧中，至今尚未被完全闡明。
為了撥開迷霧、揭示HT動態的免疫景觀，研究人員將目光投向了NOD.H-2h4小鼠——一種能夠自發產生碘誘導性自身免疫性甲狀腺炎，并能很好模擬人類HT病理特征的理想動物模型。在發表于《Biochemical and Biophysical Research Communications》上的這項研究中，研究團隊利用先進的單細胞RNA測序技術，繪制了NOD.H-2h4小鼠在疾病三個關鍵時間點（4周、8周、16周）的甲狀腺單細胞轉錄組圖譜，旨在解析細胞組成的動態變化、免疫細胞與甲狀腺細胞之間的相互作用，為理解HT的發病機制和尋找潛在治療靶點提供新見解。
研究主要采用了單細胞RNA測序技術構建和分析甲狀腺組織單細胞文庫。實驗對象為36只雌性NOD.H-2h4小鼠，通過飲用含0.05% NaI的水進行誘導，并在三個時間點采集甲狀腺組織進行測序。同時，研究者通過流式細胞術和多重免疫熒光技術，對關鍵發現（如Treg表型和APP-CD74配受體對的空間共定位）進行了實驗驗證，以支撐計算推斷的結果。
3.1. NOD.H-2h4小鼠甲狀腺免疫微環境的單細胞轉錄組圖譜
研究者對來自三個疾病階段甲狀腺組織的總計38，461個細胞進行了分析。通過降維聚類識別出12個主要細胞譜系，其中T細胞是最主要的免疫細胞群，甲狀腺濾泡細胞是第二大群體。整體炎癥水平在8周和16周顯著升高。值得注意的是，甲狀腺譜系的關鍵轉錄因子Nkx2-1（Ttf-1）的活性在甲狀腺濾泡細胞中顯著下調，提示其細胞特性和功能逐步喪失�？缥锓N相關性分析證實，該小鼠模型的炎癥轉錄特征與人類HT患者高度保守。此外，基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）顯示，甲狀腺濾泡細胞中顯著富集了“同種異體移植排斥”通路，涉及抗原加工呈遞和細胞毒性效應反應基因的上調。
3.2. 細胞間通訊網絡分析揭示配體-受體相互作用
通過分析細胞間通訊網絡，研究者發現免疫細胞主要作為信號接收者，而甲狀腺濾泡細胞、成纖維細胞等基質細胞則顯示出顯著的信號發出活性。在眾多信號通路中，APP（淀粉樣前體蛋白，Amyloid Precursor Protein）信號通路顯示出高強度的通訊能力，其靶向抗原呈遞細胞（Antigen-Presenting Cells, APCs）。重要的是，推斷出的App-Cd74軸比已知的Mif-Cd74通路擁有更強的通訊強度。該軸介導了甲狀腺濾泡細胞/基質細胞與APC之間的潛在互動。APC隨后通過MHC-I和MHC-II通路與T細胞相互作用。研究推測，App-Cd74軸可能通過激活APC并促進其向T細胞呈遞抗原，從而加劇自身免疫性組織損傷。
3.3. T細胞的轉錄異質性
在15，138個T細胞中，研究者鑒定出13個不同的T細胞亞群，包括Na?ve T細胞、Ectopic Thymocytes（異位胸腺細胞）、Th1、Th17、調節性T細胞（Regulatory T cells， Treg）、CD8+細胞毒性T細胞（Cytotoxic T lymphocytes， CTL）等。隨著疾病進展，促炎效應亞群（如Th1、CD8+CTL、自然殺傷T細胞（NKT））的比例顯著增加。
3.4. 將雙陽性T細胞鑒定并驗證為異位胸腺細胞
研究者在數據集中識別出一群CD4+CD8+的雙陽性T細胞。通過轉錄組分析和免疫熒光驗證，證實這群細胞來源于與甲狀腺組織粘連的異位胸腺結構，在未誘導小鼠中占淋巴細胞主體，并且在疾病進程中持續存在。由于其發育表型和空間上獨立于炎癥實質，它們被歸類為異位胸腺細胞，并從后續的細胞通訊分析中排除。
3.5. T細胞的擬時序和發育軌跡
擬時序（pseudotime）軌跡分析顯示T細胞可分為三個狀態。隨著疾病進展，處于早期狀態的細胞（如Na?ve T細胞）比例下降，而代表分化功能表型的State 2和State 3細胞擴張。功能富集分析表明，State 2細胞與細胞毒性、自身免疫反應通路相關，而State 3細胞則與免疫調節、免疫耐受通路相關。
3.6. CD4+T細胞重塑和Treg功能不穩定
盡管Treg細胞的比例隨疾病進展而增加，但其關鍵轉錄因子Foxp3的表達及相關通路顯著抑制，提示其功能衰竭。流式細胞術驗證也顯示NaI誘導組小鼠甲狀腺中FOXP3蛋白表達減弱。基因調控網絡（Gene Regulatory Network， GRN）分析識別出調控Foxp3的關鍵轉錄因子，其活性在晚期疾病階段顯著下降，與Treg功能障礙的表型相吻合。相比之下，Th1細胞顯示出廣泛的免疫通路激活，可能加劇炎癥。
3.7. CD8+CTL和NKT的積累
CD8+CTL和NKT細胞比例顯著增加，它們在組織中主要負責破壞作用。GSEA分析顯示這些細胞在疾病中后期的細胞毒性活性增強，并富集了MHC介導的抗原呈遞過程，表明存在一個組織損傷的正反饋循環。
3.8. B細胞和樹突狀細胞對抗原呈遞和免疫激活的貢獻
B細胞被分為6個簇，主要包括濾泡B細胞、記憶B細胞和漿細胞。GSEA顯示，隨著疾病進展，B細胞的抗原反應和MHC復合體呈遞相關通路被上調，提示B細胞除了產生自身抗體外，還可能作為APC來維持T細胞活化。樹突狀細胞（Dendritic cells， DCs）被分為cDC1、cDC2和pDC。cDC1富集于MHC-I介導的抗原呈遞，而cDC2則主要促進免疫激活。
3.9. 巨噬細胞向促炎M1表型極化
巨噬細胞被分為13個簇，主要歸類為促炎的M1型和抗炎的M2型。在8周組，M1巨噬細胞顯示出抗原呈遞和炎癥活性。令人意外的是，在組織損傷嚴重的16周組，M1巨噬細胞反而表現出免疫耐受通路的激活，可能是一種限制免疫病理的負反饋機制。
3.10. 甲狀腺濾泡細胞的轉錄異質性和擬時序分析
對甲狀腺濾泡細胞進行亞群分析，識別出14個簇，并根據功能和免疫相關基因表達注釋為6個功能亞型：成熟甲狀腺濾泡細胞、抗原呈遞甲狀腺濾泡細胞、炎癥性甲狀腺濾泡細胞、應激性甲狀腺濾泡細胞、結構性甲狀腺濾泡細胞和周期循環甲狀腺濾泡細胞。隨著疾病進展，抗原呈遞型和炎癥型甲狀腺濾泡細胞顯著擴張，而成熟型細胞比例下降，且“甲狀腺激素代謝過程”通路被顯著下調，表明甲狀腺功能廣泛受損。擬時序軌跡分析揭示了甲狀腺濾泡細胞從根狀態（State 1， 主要為成熟和應激細胞）分化為兩個不同終端命運（State 2和State 3）的過程，慢性應激驅使細胞向炎癥/抗原呈遞表型轉變。
3.11. 甲狀腺基質微環境失調
非甲狀腺濾泡區的轉錄譜分析顯示微環境廣泛失調。例如，成纖維細胞富集了炎癥通路，內皮細胞的血管生成通路被下調，上皮細胞的免疫和轉移相關信號被上調，這些都加劇了局部自身免疫反應并阻礙了組織修復。
討論與結論
本研究通過構建NOD.H-2h4小鼠模型的單細胞轉錄組圖譜，揭示了在疾病進展中甲狀腺細胞與免疫細胞之間潛在的復雜相互作用。核心發現包括：
- 1.
甲狀腺濾泡細胞的可塑性：慢性應激誘導甲狀腺濾泡細胞獲得炎癥和抗原呈遞表型，其身份關鍵調控因子Nkx2-1活性下調，功能受損。
- 2.
關鍵的細胞間通訊軸：研究推斷出App-Cd74是連接甲狀腺濾泡細胞/基質細胞與抗原呈遞細胞的新信號軸，其強度與疾病嚴重程度正相關。該軸可能通過激活APC，進而通過MHC通路激活T細胞，形成一個多細胞級聯信號放大機制，驅動自身免疫攻擊。
- 3.
T細胞庫重塑與Treg功能障礙：浸潤的T細胞向細胞毒性效應表型（如Th1、CD8+CTL）傾斜。盡管Treg數量增加，但其關鍵的Foxp3通路及相關轉錄因子（如Ets1）活性下降，導致其免疫抑制功能衰竭，無法有效控制炎癥。
- 4.
異位胸腺的存在：研究在甲狀腺旁鑒定出具有功能的異位胸腺組織，這在NOD背景小鼠中是常見現象，為理解局部免疫環境提供了新維度。
- 5.
基質微環境失調：成纖維細胞、內皮細胞等非免疫細胞也發生了顯著的促炎和功能障礙性轉錄重編程，共同塑造了致病的組織微環境。
綜上所述，這項研究系統描繪了自身免疫性甲狀腺炎動態演進的細胞和分子圖譜，提出了甲狀腺濾泡細胞轉錄可塑性和Treg功能不穩定是驅動疾病進展的潛在機制，并揭示了App-Cd74軸作為一個有待深入驗證的新信號通路。這些發現不僅為理解HT的發病機制提供了寶貴的基礎數據和新的理論視角，也為未來開發針對特定細胞狀態或信號通路的干預策略（如恢復Treg功能或阻斷致病性細胞間通訊）指明了潛在方向。
