《Entomologia Experimentalis et Applicata》：Molecular Phylogeny and Strain Genotyping of the Bacterial Endosymbiont Wolbachia Associated With Tuta absoluta Populations
編輯推薦：
本文是一項針對入侵性害蟲番茄潛葉蛾(Tuta absoluta)的深入研究。作者對來自印度10個地區的種群進行了篩查，發現其普遍感染共生菌沃爾巴克氏體(Wolbachia)，感染率高達42.8%–91.7%，而其他常見共生菌(Arsenophonus, Cardinium, Spiroplasma)則未檢出。通過多位點序列分型(MLST)和wsp基因分析，鑒定出兩種優勢菌株序列型(ST41和ST367)，分別屬于沃爾巴克氏體的B和A超群。研究發現，番茄潛葉蛾體內沃爾巴克氏體的高流行率和低遺傳多樣性，為未來開發基于沃爾巴克氏體的害蟲生物防控策略提供了關鍵的分子依據和潛在的應用前景。
引言
番茄潛葉蛾(Tuta absoluta)，又名Phthorimaea absoluta，是一種對番茄和其他茄科植物危害嚴重的經濟入侵害蟲，原產于南美洲，現已擴散至全球多地，包括印度。該害蟲繁殖能力強，已對多種常用殺蟲劑產生抗性，因此開發環境友好型的綜合治理策略至關重要。昆蟲不育技術(SIT)和遺傳不育技術(IS)是行之有效的害蟲防治方法。此外，昆蟲體內的細胞內共生細菌，如沃爾巴克氏體(Wolbachia)，能夠誘導宿主的生殖調控，例如導致細胞質不親和性(CI)，即被感染的雄性與未感染的雌性交配后后代無法存活，這為害蟲管理提供了新思路。沃爾巴克氏體是阿爾法變形菌綱的一種母系遺傳的胞內共生菌，在昆蟲中感染廣泛，能通過多種機制（如雌性化、孤雌生殖、殺雄作用和CI）調控宿主生殖。基于多位點序列分型(MLST)和wsp基因等分子標記，已鑒定出多個沃爾巴克氏體超群，其中A和B超群在節肢動物中最為常見。本研究旨在調查印度番茄潛葉蛾自然種群中多種生殖共生菌的感染情況，并重點對檢出的沃爾巴克氏體進行菌株分型和系統發育分析，以期為其生物防治應用奠定基礎。
材料與方法
研究于2017年至2019年間，在印度6個邦的10個地點及一個實驗室種群中采集了番茄潛葉蛾雄性成蟲樣本。樣本通過信息素誘捕器收集，并采用CTAB法提取個體基因組DNA。首先，使用針對16S rRNA基因的特異性引物，通過PCR檢測樣本是否感染四種常見的生殖共生菌：Arsenophonus、Cardinium、Spiroplasma和Wolbachia。同時，通過擴增線粒體12S rRNA基因和細胞色素c氧化酶亞基I(mtCOI)基因來確保DNA質量和鑒定宿主物種。
對于沃爾巴克氏體陽性的樣本，進一步采用MLST方法進行菌株分型。MLST分析基于五個看家基因：gatB、coxA、hcpA、ftsZ和fbpA，以及Wolbachia表面蛋白基因(wsp)。所有PCR產物經純化后進行雙向測序，獲得的序列提交至GenBank。利用ClustalW進行序列比對，并通過貝葉斯推斷法構建系統發育樹。使用Brugia malayi（一種絲蟲）的序列作為外群，以確定沃爾巴克氏體菌株所屬的超群。感染率數據進行了統計學分析（單因素方差分析和卡方檢驗）。
結果
3.1 生殖共生菌的流行情況
在篩查的126個樣本（116個野外樣本和10個實驗室樣本）中，未檢測到Arsenophonus、Cardinium和Spiroplasma的感染。然而，沃爾巴克氏體感染廣泛存在，感染率在不同種群間存在顯著差異，范圍在42.8%至91.7%之間。感染率最高的地區是哈里亞納邦的希薩爾(91.7%)，其次是特倫甘納邦的馬哈布卜納加爾(85.7%)，馬哈拉施特拉邦的納西克和卡納塔克邦的賴丘爾均為83.3%。感染率最低的地區是卡納塔克邦的卡勒布勒吉(42.8%)和泰米爾納德邦的哥印拜陀(50.0%)。
3.2 基于MLST/wsp的沃爾巴克氏體菌株分型
對沃爾巴克氏體陽性樣本的MLST和wsp基因分析顯示，除卡勒布勒吉地區的一個樣本外，所有其他樣本（包括實驗室種群）均攜帶相同的優勢菌株序列型——ST41，其MLST等位基因組合（gatB-39， coxA-14， hcpA-40， ftsZ-36， fbpA-4）和wsp等位基因（等位基因10）完全一致。然而，來自卡勒布勒吉地區的一個樣本(TaK2)顯示出一個新的序列型——ST367，其MLST等位基因組合（gatB-3， coxA-194， hcpA-222， ftsZ-171， fbpA-3）和wsp等位基因（等位基因427）均與ST41不同，其wsp高變區(HVR)模式也相異。
3.3 系統發育分析
基于16S rRNA基因、串聯的MLST基因以及wsp基因序列構建的系統發育樹表明，本研究中番茄潛葉蛾感染的沃爾巴克氏體菌株歸屬于兩個超群。攜帶ST41的菌株全部聚集在超群B中，該超群包含來自鱗翅目、雙翅目、鞘翅目和直翅目等多種昆蟲的沃爾巴克氏體菌株。而攜帶ST367的菌株（來自卡勒布勒吉的TaK2）則歸屬于超群A，該超群也包含來自多種昆蟲的菌株。
討論
本研究證實，在印度的番茄潛葉蛾種群中，沃爾巴克氏體是唯一被檢出的常見生殖共生菌，這與來自克羅地亞、伊朗、土耳其和阿根廷等地的研究結果一致，說明Arsenophonus、Cardinium和Spiroplasma可能并非該害蟲的常見共生伙伴。沃爾巴克氏體的感染率呈現顯著的地理變異，可能與宿主種群遺傳、環境因素或采樣時間有關。
系統發育分析結果表明，印度番茄潛葉蛾種群主要感染屬于超群B的沃爾巴克氏體ST41菌株，這與來自巴西、南非和阿根廷的報道相符，表明該菌株可能是全球番茄潛葉蛾種群中一個廣泛傳播且保守的優勢譜系。然而，在印度南部卡勒布勒吉地區發現的一個樣本感染了屬于超群A的新序列型ST367，這提示了沃爾巴克氏體菌株在局部可能存在多樣性。這種多樣性可能源于水平轉移事件，例如通過寄生蜂或其他生態相互作用在不同昆蟲宿主間傳播。
沃爾巴克氏體在番茄潛葉蛾中能誘導細胞質不親和性(CI)，但不會導致孤雌生殖。其高感染率和相對較低的遺傳多樣性（主要圍繞ST41）是一個有利因素，因為這意味著基于單一優勢沃爾巴克氏體菌株來開發種群壓制策略（如利用CI效應）可能具有更高的可行性和效率。通過釋放感染特定沃爾巴克氏體菌株的雄性昆蟲，可以與野外未感染或感染不同菌株的雌性產生CI，從而降低害蟲種群數量。
結論
綜上所述，本研究首次對印度番茄潛葉蛾種群的生殖內共生菌進行了系統性調查和分子特征分析。結果表明，沃爾巴克氏體（主要為ST41型）是該害蟲種群中高度流行且占主導地位的共生菌，而其他共生菌則未被發現。發現了一個新的ST367型菌株，豐富了我們對沃爾巴克氏體在該害蟲中多樣性的認知。這些發現為了解番茄潛葉蛾與共生微生物的互作關系提供了重要數據，并凸顯了利用沃爾巴克氏體介導的細胞質不親和性(CI)作為一種環境友好的、有潛力的生物防治工具來管理這一全球性重大害蟲的可能性。未來的研究需要進一步評估這些菌株誘導CI的強度，并探索將其與昆蟲不育技術(SIT)相結合的綜合治理策略。
