酶，特別是脂肪酶，因其特異性、高效性及在溫和條件下工作的能力，在眾多領域具有重要價值。然而，其實際應用常受限于穩定性差、難以重復使用、成本高昂以及產物可能被酶殘留污染等問題。酶固定化技術，即將酶結合到不溶性載體材料上，是解決這些挑戰的有效途徑。它不僅能克服酶回收的難題，還便于下游加工和連續操作，且在多數情況下能改善酶的性質。

酶固定化的技術多種多樣，包括吸附、包埋、封裝、共價結合和交聯等。根據酶與載體相互作用的性質，這些方法可分為可逆與不可逆兩大類。其中，共價結合和交聯法是兩種最常用的不可逆固定化技術。在交聯法中，酶分子之間通過交聯劑形成共價鍵，生成穩定的三維酶網絡，無需載體材料。盡管此法能有效提高酶的穩定性、可重用性和在不同條件下的活性，但也存在局限性，例如若交聯不當可能導致機械穩定性低和酶滲漏。此外，通過離心或過濾從反應混合物中分離交聯酶聚集體用于后續使用時，可能導致進一步聚集，增大尺寸，從而引起內部傳質限制，降低固定化酶的效率。為解決這些問題，磁交聯酶聚集體等創新策略被提出。在共價固定化中，酶分子的氨基酸殘基與載體表面引入的活性官能團之間形成穩定的共價鍵。當酶從載體滲漏的風險較高時，這種不可逆固定化是首選的附著方法。共價固定在載體上的酶的性能受多種因素影響，包括載體的形狀、尺寸和材料組成等特性，以及用于將酶固定到載體的方法和偶聯過程中的具體條件。因此，選擇合適的固定化載體和技術對于創建有效的生物催化劑至關重要。

金屬有機框架（MOFs）因其低密度、大比表面積、高穩定性和結構可調性，成為酶固定化中廣泛應用的多孔結晶納米材料。其中，鋯基MOFs（Zr-MOFs）以其多樣的結構設計和顯著的化學、熱及水穩定性而聞名，在暴露于相當大的機械應力時也能保持結構完整性。這種耐久性主要歸功于其框架中強大的Zr-O配位鍵和堅固的次級結構單元。因此，這類MOFs在酶固定化領域引起了極大的興趣。為了進一步增強這些框架的功能性，可以將磁性組分（如Fe₃O₄、CoFe₂O₄）摻入其結構中，形成納米磁性MOFs。這通常通過將磁性納米顆粒嵌入MOF基質中或在磁性核上生長MOFs來實現。這些納米磁性MOFs便于使用外部磁場從反應混合物中輕松分離和回收固定化酶，從而增強了其在生物催化和其他生物醫學領域的實際應用性。納米磁性MOFs的結構化孔隙率和功能可調性也允許與酶進行定制化相互作用，從而提高酶的活性和穩定性。然而，當使用鋯基MOFs作為酶固定化載體時，選擇合適的緩沖溶液至關重要，因為緩沖液的一些成分可能與MOF的金屬中心或有機連接體相互作用，導致金屬離子浸出或框架結構降解。

本研究重點聚焦于使用兩種不同方法——沉淀-交聯法和共價結合法，將Humicola insolens脂肪酶固定到鋯鐵氧體（ZrFe₂O₄）磁性納米顆粒及其復合物ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂上。研究考察了緩沖體系（特別是磷酸鉀緩沖液和Tris-HCl緩沖液）對酶固定化過程中UiO-66-NH₂框架穩定性的影響。在對獲得的生物催化劑進行全面表征后，闡明兩種固定化技術對酶負載量、固定效率、熱穩定性和可重復使用性的影響。

研究使用的材料包括購自諾維信的Humicola insolens脂肪酶，以及ZrOCl₂·8H₂O、FeCl₂·4H₂O、2-氨基對苯二甲酸（ATA）、ZrCl₄等化學試劑。采用了包括傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）、掃描電子顯微鏡（SEM）、能量色散X射線光譜（EDX）、X射線衍射（XRD）、Brunauer–Emmett–Teller（BET）比表面積分析、動態光散射（DLS）和熱重分析（TGA）在內的多種技術對合成的載體和生物催化劑進行表征。

采用化學共沉淀法合成了鋯鐵氧體磁性納米顆粒。將ZrOCl₂·8H₂O和FeCl₂·4H₂O加入80°C的蒸餾水中，在氮氣氛圍下劇烈磁力攪拌，并通過加入氫氧化鈉溶液（2 M）將反應混合物的pH調節至10-12，直至出現黑色沉淀。將所得沉淀冷卻至室溫，用外部磁鐵分離，并用去離子水徹底洗滌，最后在70°C下干燥12小時。

將0.25 g合成的ZrFe₂O₄納米顆粒在30 mL DMF中超聲分散20分鐘形成均勻分散體。隨后，將1 mmol的ZrCl₄和1 mmol的2-氨基對苯二甲酸加入磁性納米顆粒懸浮液中，并超聲處理15分鐘。將反應混合物倒入100 mL聚四氟乙烯內襯的高壓釜中，密封并在120°C下保持24小時。容器冷卻至室溫后，用磁鐵收集所得固體產物，并用乙醇洗滌。

ZrFe₂O₄納米顆粒表面首先通過硅烷化過程使用3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）進行氨基功能化。隨后，將APTES修飾的納米顆粒用戊二醛進一步功能化以引入醛基，從而能夠實現共價酶結合。根據相同的方法，通過戊二醛中的醛基與UiO-66-NH₂中連接體的氨基之間的希夫堿反應，對ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂納米顆粒進行修飾。

將10 mg每種修飾的納米載體懸浮在含有1 mL酶溶液（8.5 mg mL^-1，0.01 M緩沖液，pH 7.4）的Eppendorf管中，在室溫下于400 rpm的恒溫振蕩器中孵育5小時。固定化完成后，用磁鐵分離沉淀并用Tris-HCl緩沖液洗滌。

根據先前報道的程序，通過沉淀-交聯法將酶固定到氨基硅烷功能化的鋯鐵氧體和ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂載體上。將20 mg每種納米載體分散在含有500 μL酶溶液（34 mg mL^-1，50 mM緩沖液，pH 7.4）的管中。將2.26 mL飽和硫酸銨溶液引入混合物中，隨后在4°C下攪拌30分鐘。將適量體積的戊二醛（25%）注入上述混合物中并振蕩，以使酶分子與載體材料交聯2小時。孵育時間后，通過將含有混合物的管置于磁分離器上去除上清液。隨后，將所得產物重新懸浮在Tris-HCl緩沖液中以洗去任何殘留的未反應酶。

通過FT-IR、XRD、SEM、EDX、DLS和BET等技術對合成的磁性載體進行了表征。ZrFe₂O₄的FT-IR譜圖中，568 cm^-1和453 cm^-1處的峰可分別歸屬于Fe-O和Zr-O鍵。約3431和1627 cm^-1處觀察到羥基的伸縮和彎曲振動模式，表明載體上存在吸附水分子。對于ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂載體，伯胺基團的對稱振動模式出現在3383 cm^-1，而相應的不對稱伸縮出現在3446 cm^-1。此外，在769和649 cm^-1觀察到的特征峰歸屬于Zr-O鍵的伸縮振動。1652 cm^-1處的振動頻率歸屬于N-H鍵的彎曲振動。與羧酸根的不對稱和對稱伸縮振動以及芳香胺的C-N伸縮振動相關的吸收帶分別出現在1571、1436、1377和1247 cm^-1處，這與早期文獻記錄的結果一致。

X射線衍射分析用于進一步闡明這些材料的結構組成和晶體特性。ZrFe₂O₄的XRD圖譜中，在2θ值為30.11°、35.38°、42.70°、52.54、56.74°和62.51°處觀察到的衍射峰分別對應于（220）、（311）、（400）、（422）、（511）和（440）晶面。這些峰與文獻數據吻合良好，表明ZrFe₂O₄的成功合成。ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂的XRD圖譜清楚地顯示了ZrFe₂O₄和UiO-66-NH₂的特征峰。在2θ值為7.26（111）和8.36（200）處出現的兩個特征峰與UiO-66-NH₂的晶體結構一致，證實了UiO-66-NH₂在ZrFe₂O₄納米顆粒上的成功合成和沉積。值得注意的是，與ZrFe₂O₄相關的衍射峰仍然很突出，表明在合成過程中ZrFe₂O₄的結構完整性得以保留。

通過SEM和EDX光譜進一步分析了合成載體的結構，以提供有關樣品組成及其表面形貌的更多信息。ZrFe₂O₄納米顆粒呈近乎均勻的球形，并有一定程度的團聚。團聚傾向在磁性納米顆粒中很常見，這是由于它們具有很強的磁偶極-偶極作用和范德華力。此外，EDX光譜證實了ZrFe₂O₄組合物中存在鐵（Fe）、鋯（Zr）和氧（O）。在用UiO-66-NH₂包覆后，納米顆粒保留了近乎球形的形狀，但團聚程度似乎有所降低，顆粒表現出更規則和分散良好的外觀。包覆后顆粒分散性和形態的改善可歸因于MOF層的穩定作用，其通過提供增強膠體穩定性的保護殼來防止顆粒聚集。此外，在ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂的EDX譜圖中檢測到碳和氮峰，證實了在晶體磁性核上成功合成了UIO-66-NH₂。

采用DLS技術測定了合成納米顆粒膠體分散體的粒徑分布。鋯鐵氧體納米顆粒表現出兩個不同的群體，平均直徑分別為140.8 nm和741.4 nm，分別對應于較小顆粒和輕微聚集體。計算出的Z平均流體動力學直徑為316.8 nm，多分散指數（PDI）為0.392，表明具有中等多分散性。對于ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂納米復合材料，Z平均流體動力學直徑為310.3 nm，PDI為0.462。主要顆粒群體集中在211.3 nm左右，一小部分在1373.7 nm。與原始ZrFe₂O₄相比，流體動力學直徑略小，這表明由于有效的表面功能化，膠體穩定性得到改善，聚集減少。DLS獲得的粒徑大于SEM觀察到的粒徑，這與文獻一致。這種差異歸因于布朗運動對DLS測量的影響。DLS測量的是包括核、表面層和溶劑化殼的流體動力學直徑，而SEM僅反映固體核尺寸。因此，通過DLS測量的尺寸通常大于通過電子顯微鏡技術觀察到的尺寸。

通過氮氣吸附-脫附分析評估了合成材料的織構性質，并根據IUPAC方案對等溫線進行了分類。原始ZrFe₂O₄納米顆粒表現出II型等溫線，氮氣吸附量非常有限，BET比表面積僅為15.2 m²g^-1，孔體積為0.052 cm³g^-1，平均孔徑為13.8 nm。該模式反映了裸露鐵氧體表面基本上無孔或大孔的性質。在用UiO-66-NH₂修飾后，等溫線轉變為I型輪廓，其特征是在低相對壓力下急劇吸附，這是微孔框架的典型特征。同樣，比表面積急劇增加至65.5 m²g^-1，孔體積增加至0.176 cm³g^-1，而平均孔徑減小至10.7 nm，證實了MOF殼引入了微孔性。

通過沉淀-交聯和共價結合兩種不同的方法將Humicola insolens脂肪酶固定在ZrFe₂O₄和ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂納米顆粒載體上。通過FT-IR光譜、XRD、TGA、SEM和EDX分析等一系列綜合技術對所得生物催化劑進行了表征。為了創建酶的共價連接，首先用APTES修飾ZrFe₂O₄納米顆粒的表面，然后用戊二醛處理。在APTES修飾的納米顆粒光譜中，1052 cm^-1處觀察到的峰可歸屬于Si-O鍵的伸縮振動。此外，在2923和2851 cm^-1處分別檢測到與CH₂基團的不對稱和對稱伸縮振動相關的吸收帶。在載體用戊二醛處理后，在1716 cm^-1處出現新的FT-IR吸收帶，證明戊二醛已通過胺官能團有效地與載體結合。酶在ZrFe₂O₄納米顆粒上的固定化通過1052 cm^-1處光譜帶相對強度的增加以及其各自吸收最大值的顯著移動得到證明。此外，在1453、1340和1651 cm^-1附近出現吸收帶，表明酶與功能化載體之間發生了交聯反應。

ZrFe₂O₄納米顆粒的特征峰同樣在生物催化劑的XRD圖譜中被檢測到，表明酶分子的摻入并未改變載體的晶體結構。此外，利用熱重分析（TGA）觀察了所制備生物催化劑的熱分解過程。在100°C以下檢測到的初始質量減少（約5%）與物理吸附水的蒸發以及樣品的部分脫水有關。隨后，在TGA曲線上觀察到直至約275°C的質量逐漸下降，隨后在300至450°C之間發生更急劇的質量損失�？傮w而言，在100-549°C溫度范圍內觀察到的約23%的質量減少歸因于固定在載體上的功能部分和酶分子的熱降解。

如SEM圖像所示，在脂肪酶固定化后，一些顆粒的邊界表現出一定程度的模糊，這表明固定化過程中發生的化學反應部分改變了ZrFe₂O₄納米顆粒的表面形態。通過EDX光譜中檢測到生物催化劑對應的氮和硫光譜峰，進一步證實了酶在載體上的固定化。

圖示了Humicola insolens脂肪酶、戊二醛功能化的ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂納米顆粒以及由此產生的生物催化劑對應的紅外光譜。在1708 cm^-1處觀察到的峰證明，作為酶附著交聯劑的戊二醛已與載體的胺基有效反應。在酶固定化過程之后，在1051和1652 cm^-1處出現了新的特征帶，表明脂肪酶分子通過交聯反應共價結合到活化的ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂納米顆粒表面。

通過XRD、SEM和EDX光譜進一步闡明了所得生物催化劑的組成和結構特征。盡管生物催化劑XRD圖譜中峰的位置保持一致，但觀察到其強度有所變化，這可歸因于酶與載體之間的相互作用。從SEM圖像進一步觀察到，在酶固定化后，載體表面的形態特征沒有發生顯著變化。最后，通過EDX光譜中檢測到N和S峰，證實了酶與ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂納米顆粒的結合。生物催化劑的TGA曲線表明，在低于100°C的溫度下質量減少約5%，這歸因于從載體上去除吸附的水分子。失重率一直降低到約250°C，然后在250至400°C的溫度范圍內急劇加速，這與有機組分和酶分子的分解有關。

緩沖液的組成會通過降解配位鍵顯著影響MOFs的結構穩定性。因此，使用金屬有機框架作為酶載體的一個關鍵考慮因素是它們在緩沖溶液中的穩定性。磷酸鹽緩沖液由于其與活體組織和微生物良好的相容性，常用于生物和醫學應用，特別是在酶固定化領域。在本研究中，酶固定化最初在50 mM磷酸鉀緩沖液中進行。在此條件下制備的生物催化劑的FT-IR分析顯示，特征性MOF峰缺失，并且在1022 cm^-1處存在顯著的吸收，即使當載體僅暴露于不含酶的磷酸鹽緩沖液時，該吸收也持續存在。這表明觀察到的峰是由于吸附的磷酸根離子，而不是成功的酶固定化。這些觀察結果與Ahmad等人的發現非常一致。為了進一步評估磷酸鹽緩沖液對MOF結構的影響，對浸泡在磷酸鹽緩沖液后的載體進行了XRD分析。XRD圖譜顯示ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂的特征峰顯著喪失，主要衍射峰消失，結晶度顯著降低。這些結果證實磷酸鹽緩沖液會誘導MOF結構發生實質性降解。另一方面，在使用低濃度Tris-HCl緩沖液（≤10 mM）制備的生物催化劑的FT-IR光譜中，載體和酶的主要峰都清晰可辨。這表明低濃度的Tris-HCl緩沖液與UiO-66-NH₂結構高度相容。B??ek等人在研究UiO-66框架在常用緩沖溶液中的穩定性時獲得了類似的結果。磷酸鹽緩沖液會導致UiO-66結構降解，因此應避免在任何濃度下使用。相比之下，低濃度的TRIS緩沖液被推薦為UiO-66的合適介質。在磷酸鹽緩沖溶液中，磷酸根離子作為配體，能夠取代MOFs中的有機連接體。這些離子顯著降低了金屬有機框架的穩定性，特別是那些具有羧酸配體和高價金屬離子結構的框架。因此，本研究由于低濃度Tris-HCl緩沖液與載體結構的相容性，選擇其用于酶固定化。

Bradford蛋白測定法確定了附著在載體上的酶總量，而固定化脂肪酶的殘留活性通過活性測定進行評估。沉淀-交聯法在ZrFe₂O₄納米顆粒上實現了260 mg g^-1的酶負載量，固定化效率約為40%。在Z