慢性粒細(xì)胞白血�。–ML）是一種由BCR-ABL融合癌基因驅(qū)動(dòng)的造血干細(xì)胞克隆性疾病。其臨床病程通常分為慢性期（CP）、加速期和急變期（BP）。盡管酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）對(duì)CML-CP有效，但CML-BP仍然因治療耐藥和生存期短而面臨巨大挑戰(zhàn)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，表觀遺傳調(diào)控元件的異常激活會(huì)重塑癌癥的轉(zhuǎn)錄組，導(dǎo)致癌細(xì)胞對(duì)特定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子產(chǎn)生依賴性。然而，特定的轉(zhuǎn)錄機(jī)制是否以及如何促進(jìn)CML從慢性期向急變期轉(zhuǎn)化，目前尚不清楚。

為了探究CML轉(zhuǎn)化的機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)整合分析了CML患者樣本的H3K27ac染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）和RNA測(cè)序（RNA-seq）數(shù)據(jù)。通過(guò)比較分析，鑒定出24個(gè)BP特異性的超級(jí)增強(qiáng)子（SEs），并將其注釋到鄰近基因。進(jìn)一步篩選出四個(gè)在CML-BP中mRNA表達(dá)上調(diào)且受SE驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄因子：SMAD3、SOX4、CXXC5和KLF9。其中，SOX4和SMAD3在CML-BP中呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的正相關(guān)性，而在CML-CP和急性髓系白血病（AML）中則呈負(fù)相關(guān)。

在CML-BP細(xì)胞系中，敲低SOX4或SMAD3會(huì)降低另一因子的mRNA和蛋白表達(dá)水平，而過(guò)表達(dá)其中一個(gè)則會(huì)提升另一個(gè)的水平，這表明二者存在相互依賴的正向調(diào)控關(guān)系。利用BET抑制劑（ABBV-744, ARV-771）處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)SOX4和SMAD3的表達(dá)呈劑量依賴性抑制，證實(shí)了它們對(duì)SE活性的依賴。此外，對(duì)SE區(qū)域的基序分析為SOX4和SMAD3之間的相互調(diào)控關(guān)系提供了直接證據(jù)。

為了闡明其共同調(diào)控機(jī)制，研究在CML-BP細(xì)胞中進(jìn)行了針對(duì)SOX4和SMAD3的CUT&Tag分析，結(jié)果顯示這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子共同占據(jù)彼此的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū)域。染色質(zhì)免疫沉淀再沉淀（ChIP-re-ChIP）實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了SOX4和SMAD3在相同的DNA模板上共存。

研究鑒定了SOX4超級(jí)增強(qiáng)子內(nèi)的一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)（PR1）和兩個(gè)候選增強(qiáng)子成分（CE1， CE2）。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，PR1和CE2具有顯著的報(bào)告基因活性，而CE1則沒(méi)有。敲低SOX4或SMAD3會(huì)顯著降低PR1和CE2的活性，而過(guò)表達(dá)則有相反效果�；�序分析顯示，在CE2區(qū)域內(nèi)，SOX4和SMAD3的結(jié)合位點(diǎn)間距小于146個(gè)堿基對(duì)。免疫共沉淀結(jié)果也證實(shí)了SOX4和SMAD3之間存在蛋白質(zhì)相互作用。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證CE2的功能，研究利用dCas9-KRAB系統(tǒng)靶向抑制該增強(qiáng)子區(qū)域，導(dǎo)致該位點(diǎn)的H3K27ac信號(hào)顯著降低，SOX4和SMAD3的結(jié)合減少，進(jìn)而下調(diào)了SOX4的mRNA和蛋白表達(dá)，同時(shí)也降低了互作因子SMAD3的表達(dá)。這最終損害了CML-BP細(xì)胞的增殖并促進(jìn)了其紅系和巨核系分化。染色體構(gòu)象捕獲（3C）實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SOX4-CE2與SOX4啟動(dòng)子之間存在直接的染色體空間相互作用。

為研究SOX4和SMAD3在CML轉(zhuǎn)錄組調(diào)控中的機(jī)制基礎(chǔ)，研究分析了它們?cè)贑ML細(xì)胞中的表觀基因組占據(jù)特征。結(jié)果顯示，SOX4和SMAD3在啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域的協(xié)同占據(jù)（雙重結(jié)合）遠(yuǎn)多于單獨(dú)占據(jù)。與單獨(dú)結(jié)合區(qū)域相比，雙重結(jié)合區(qū)域表現(xiàn)出更高的H3K27ac信號(hào)強(qiáng)度，并且更可能與超級(jí)增強(qiáng)子重疊。匹配的RNA-Seq數(shù)據(jù)分析表明，與雙重結(jié)合的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子相關(guān)的基因表達(dá)水平顯著高于單獨(dú)結(jié)合的基因，支持了SOX4和SMAD3的協(xié)同轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

在約40%的同時(shí)含有SOX4和SMAD3基序的雙重結(jié)合區(qū)域中，結(jié)合位點(diǎn)位于核小體跨度距離內(nèi)。在細(xì)胞中敲低任一因子會(huì)全局性減少兩個(gè)伙伴蛋白的結(jié)合，并伴有H3K27ac信號(hào)的減弱。RNA-seq和基因集富集分析（GSEA）顯示，敲低SOX4后減少或增加的基因，在敲低SMAD3后也同樣顯著富集。這些共下調(diào)的基因在來(lái)自患者的“急變期”相關(guān)基因集中顯著富集。這些發(fā)現(xiàn)確立了SOX4/SMAD3協(xié)同性是CML進(jìn)展（特別是急變轉(zhuǎn)化）中轉(zhuǎn)錄失調(diào)的一個(gè)機(jī)制特征。

功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CML-BP細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化依賴于SOX4和SMAD3的表達(dá)。在所有測(cè)試的CML-BP細(xì)胞系中，敲低SOX4或SMAD3均導(dǎo)致細(xì)胞增殖速率減慢，而過(guò)表達(dá)則增強(qiáng)了CML細(xì)胞的增殖能力。此外，SOX4/SMAD3敲低顯著降低了細(xì)胞的克隆形成能力。在分化方面，敲低SOX4或SMAD3促進(jìn)了LAMA-84細(xì)胞的巨核細(xì)胞分化（CD61標(biāo)記）和紅系分化（CD71標(biāo)記），并增強(qiáng)了KBM5細(xì)胞在全反式維甲酸（ATRA）刺激下的粒細(xì)胞分化（CD11b標(biāo)記）。而過(guò)表達(dá)SOX4/SMAD3則降低了K562細(xì)胞中巨核系和紅系分化陽(yáng)性細(xì)胞的比例。

當(dāng)同時(shí)敲低SOX4和SMAD3時(shí)，對(duì)CML細(xì)胞增殖和分化能力的影響比單獨(dú)敲低任一因子更顯著。此外，過(guò)表達(dá)對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子可以部分恢復(fù)敲低后的表型，例如過(guò)表達(dá)SMAD3可以恢復(fù)敲低SOX4所導(dǎo)致的增殖能力下降和原始細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力減弱�？傊�，SOX4和SMAD3協(xié)同促進(jìn)增殖、抑制分化，從而推動(dòng)CML進(jìn)展。

通路富集分析發(fā)現(xiàn)，敲低SOX4或SMAD3后共下調(diào)的基因在“受體酪氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)”及其相關(guān)的“酶聯(lián)受體信號(hào)傳導(dǎo)”以及“脂質(zhì)代謝”等通路中富集。考慮到BCR-ABL在CML中的核心作用，研究首先驗(yàn)證了其是否參與SOX4/SMAD3驅(qū)動(dòng)的CML進(jìn)展。結(jié)果表明，敲低SOX4/SMAD3并未改變BCR-ABL的mRNA或蛋白水平，提示SOX4/SMAD3可能調(diào)控了其他的酪氨酸激酶信號(hào)通路。

通過(guò)綜合分析兩個(gè)通路中受調(diào)控的受體表達(dá)變化，研究確定AXL是一個(gè)共同的下游受體。AXL最初在CML中被鑒定，且已有報(bào)道與CML的耐藥性相關(guān)。CUT&Tag分析顯示，SOX4/SMAD3主要結(jié)合在AXL的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件上。敲低SOX4或SMAD3抑制了AXL的表達(dá)。功能上，敲低AXL損害了CML細(xì)胞的增殖并促進(jìn)了其分化。同樣，選擇性AXL抑制劑Bemcentinib也能有效抑制CML細(xì)胞增殖并促進(jìn)分化。

免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)，無(wú)論是遺傳學(xué)上敲低SOX4、SMAD3或AXL，還是藥理學(xué)上使用Bemcentinib抑制AXL，均能降低CML細(xì)胞中STAT5、AKT和ERK的磷酸化水平。值得注意的是，AXL同樣不調(diào)控BCR-ABL的表達(dá)或磷酸化，表明SOX4/SMAD3可能通過(guò)AXL介導(dǎo)的、不依賴BCR-ABL的致癌通路促進(jìn)CML進(jìn)展。利用SynergyFinder工具評(píng)估伊馬替尼和Bemcentinib的協(xié)同效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)兩種藥物之間存在強(qiáng)協(xié)同作用。

過(guò)表達(dá)AXL可以挽救由敲低SOX4或SMAD3引起的生長(zhǎng)缺陷，阻止細(xì)胞分化，并激活下游關(guān)鍵介導(dǎo)因子的磷酸化。AXL作為膜受體，其功能主要依賴于與配體GAS6的結(jié)合。研究證實(shí)敲低SOX4、SMAD3或AXL不影響內(nèi)源性GAS6的表達(dá)。添加外源性GAS6僅能輕微挽救SOX4/SMAD3敲低細(xì)胞的增殖表型，但對(duì)AXL敲低細(xì)胞無(wú)效，這可能與AXL表達(dá)量極低有關(guān)。

令人意外的是，免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)，敲低SOX4和SMAD3不僅降低了AXL的表達(dá)，還減少了其在細(xì)胞膜上的定位。對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光漂白恢復(fù)（FRAP）實(shí)驗(yàn)表明，敲低SOX4/SMAD3導(dǎo)致了細(xì)胞膜流動(dòng)性的增加。這些數(shù)據(jù)表明，SOX4/SMAD3協(xié)同促進(jìn)AXL的轉(zhuǎn)錄，并通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜流動(dòng)性來(lái)調(diào)控其膜定位，從而激活CML中的致癌信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

通路分析提示SOX4/SMAD3調(diào)控脂質(zhì)代謝。GSEA也顯示脂質(zhì)代謝基因集在CML-BP中顯著富集，表明脂質(zhì)代謝失調(diào)可能是急變期進(jìn)展的一個(gè)潛在特征。深入分析“脂質(zhì)代謝”富集基因，發(fā)現(xiàn)這些基因富集于磷脂代謝和特定的磷脂酰膽堿（PC）代謝通路中。磷脂（PL），特別是PC，是細(xì)胞膜的主要成分，其飽和度與膜的序性和流動(dòng)性密切相關(guān)。

為了量化SOX4/SMAD3對(duì)脂質(zhì)代謝的影響，研究對(duì)LAMA-84細(xì)胞進(jìn)行了非靶向脂質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果顯示，敲低SOX4或SMAD3引起了磷脂譜的顯著變化，表現(xiàn)為含有飽和脂肪酸（SFA）和單不飽和脂肪酸（MUFA）的磷脂比例顯著下降，而含有多不飽和脂肪酸（PUFA）的磷脂比例上升。

選擇變化最明顯的飽和磷脂DPPC（16:0/16:0）和單不飽和磷脂POPC（16:0/18:1）進(jìn)行挽救實(shí)驗(yàn)。增殖實(shí)驗(yàn)表明，外源性添加DPPC能更顯著地挽救由SOX4/SMAD3敲低引起的增殖缺陷。一致地，DPPC也能部分挽救分化表型。FRAP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，外源性添加DPPC并將其摻入質(zhì)膜后，能恢復(fù)SOX4和SMAD3敲低細(xì)胞中增加的膜流動(dòng)性，從而恢復(fù)了AXL的膜定位和激活。這表明SOX4/SMAD3不僅直接調(diào)控AXL表達(dá)，還通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝介導(dǎo)其分布。

結(jié)合RNA-seq和CUT&Tag數(shù)據(jù)，研究聚焦于膜脂重塑的關(guān)鍵酶LPCAT1。SOX4和SMAD3直接結(jié)合在LPCAT1的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件上。LPCAT1在CML-BP患者中表達(dá)上調(diào)。敲低SOX4或SMAD3抑制了LPCAT1的mRNA和蛋白表達(dá)。

為確認(rèn)LPCAT1的作用，研究利用shRNA沉默其表達(dá)，其結(jié)果與敲低SOX4/SMAD3的表型一致：導(dǎo)致脂質(zhì)含量（尤其是磷脂）發(fā)生變化，降低了膜磷脂的飽和程度，DPPC含量也大幅減少。LPCAT1的敲低改變了膜的序性和流動(dòng)性，從而促進(jìn)了AXL從質(zhì)膜內(nèi)化至細(xì)胞內(nèi)區(qū)室。此外，LPCAT1敲低削弱了細(xì)胞增殖，促進(jìn)了分化，并減少了AXL介導(dǎo)的下游信號(hào)激活。

為闡明LPCAT1介導(dǎo)的膜磷脂重塑作為SOX4/SMAD3下游介質(zhì)的重要作用，研究嘗試通過(guò)過(guò)表達(dá)LPCAT1 cDNA來(lái)挽救shSOX4或shSMAD3的增殖表型。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)LPCAT1確實(shí)恢復(fù)了膜流動(dòng)性、增殖能力、AXL膜定位及其激活。此外，LPCAT1敲低表型可通過(guò)補(bǔ)充DPPC或過(guò)表達(dá)AXL得到部分恢復(fù)。最后，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單獨(dú)過(guò)表達(dá)AXL或LPCAT1，或單獨(dú)補(bǔ)充DPPC，均不能完全逆轉(zhuǎn)SOX4/SMAD3敲低導(dǎo)致的增殖缺陷，只有聯(lián)合干預(yù)才能完全恢復(fù)表型，這表明SOX4/SMAD3通過(guò)雙重調(diào)控機(jī)制（直接轉(zhuǎn)錄激活A(yù)XL和通過(guò)LPCAT1調(diào)節(jié)其膜定位）發(fā)揮作用。

為探究SOX4和SMAD3在CML進(jìn)展中的體內(nèi)作用，研究采用了兩種成熟的小鼠模型：一種僅由BCR-ABL驅(qū)動(dòng)（BA CML小鼠），另一種共表達(dá)BCR-ABL與NUP98-HOXA9（BA/NH CML小鼠）。無(wú)論何種遺傳背景，敲低SOX4或SMAD3均能一致抑制疾病進(jìn)展。具體表現(xiàn)為：外周血中GFP⁺白血病細(xì)胞和白細(xì)胞總數(shù)減少；受體小鼠骨髓中GFP⁺髓系白血病細(xì)胞的植入受到顯著抑制，并伴有分化傾向；脾腫大嚴(yán)重程度減輕，白血病細(xì)胞浸潤(rùn)減弱。流式分選的GFP⁺白血病細(xì)胞顯示，SOX4和SMAD3在體內(nèi)存在mRNA和蛋白水平的相互調(diào)控，并對(duì)AXL和LPCAT1有調(diào)控作用。

非靶向脂質(zhì)組學(xué)分析揭示，敲低SOX4/SMAD3誘導(dǎo)了BA CML小鼠體內(nèi)顯著的脂質(zhì)失調(diào)，其特征是磷脂種類(lèi)（特別是PC）發(fā)生顯著改變。對(duì)磷脂飽和度的進(jìn)一步分析表明，與人類(lèi)CML-BP細(xì)胞系中的觀察一致，敲低轉(zhuǎn)錄因子降低了SFA-PL和MUFA-PL的比例。機(jī)制上，對(duì)BA CML小鼠白血病細(xì)胞的CUT&Tag分析證實(shí)，SOX4和SMAD3在全基因組范圍內(nèi)主要共占據(jù)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域，并且相互結(jié)合在彼此的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域。此外，兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子都直接結(jié)合在AXL和LPCAT1的調(diào)控元件上。重要的是，敲低SOX4或SMAD3顯著延長(zhǎng)了CML-BP小鼠的生存期，凸顯了該軸在疾病維持中的功能必要性。

接下來(lái)，研究在兩種CML小鼠模型中檢驗(yàn)了AXL抑制劑Bemcentinib的體內(nèi)效果。與預(yù)期一致，Bemcentinib治療顯著減少了外周血中的GFP⁺白血病細(xì)胞，降低了白細(xì)胞計(jì)數(shù)，減輕了骨髓中的白血病細(xì)胞負(fù)荷，促進(jìn)了細(xì)胞分化，并緩解了脾臟的病理嚴(yán)重程度。免疫印跡結(jié)果顯示，Bemcentinib顯著阻斷了白血病細(xì)胞中AXL的激活。此外，治療耐受性良好，體重?zé)o顯著變化，血清肝腎功能指標(biāo)（ALT， AST， CR）與對(duì)照組相當(dāng)�？傊�，藥理學(xué)抑制AXL延緩了CML的進(jìn)展，Bemcentinib代表了一種有前景的CML治療策略。

由超級(jí)增強(qiáng)子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄失調(diào)在其他癌癥的發(fā)生發(fā)展中已被廣泛研究，但在CML進(jìn)展中鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)不同臨床階段CML患者樣本進(jìn)行H3K27ac ChIP-seq和RNA-seq，經(jīng)過(guò)整合多組學(xué)分析和嚴(yán)格篩選，鑒定出4個(gè)候選轉(zhuǎn)錄因子。有趣的是，SOX4和SMAD3僅在CML-BP中表現(xiàn)出高度相關(guān)性，并進(jìn)一步驗(yàn)證了它們通過(guò)共結(jié)合彼此的以及自身的增強(qiáng)子或啟動(dòng)子元件來(lái)相互調(diào)控轉(zhuǎn)錄。SOX4和SMAD3以小于150 bp的間距協(xié)同結(jié)合，并由核小體以及直接的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用介導(dǎo)，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的穩(wěn)定性。

SOX4在急性白血病中作為癌基因發(fā)揮作用，而SMAD3作為T(mén)GF-β信號(hào)效應(yīng)子，與FOXO3a協(xié)同調(diào)控轉(zhuǎn)錄，是CML干細(xì)胞維持所必需的。然而，SOX4和SMAD3在CML轉(zhuǎn)化中的作用此前尚未見(jiàn)報(bào)道。

在本研究中，發(fā)現(xiàn)SOX4和SMAD3在體外和體內(nèi)協(xié)同加速CML的惡性進(jìn)展。為了闡明機(jī)制，研究在敲低每個(gè)轉(zhuǎn)錄因子后進(jìn)行了RNA-seq通路富集分析。由于與CML生物學(xué)相關(guān)，優(yōu)先研究了兩個(gè)重疊的高排名通路（受體酪氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)和脂質(zhì)代謝）。在“受體酪氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)”通路的候選基因中，發(fā)現(xiàn)SOX4和SMAD3通過(guò)結(jié)合其啟動(dòng)子和增強(qiáng)子直接調(diào)控AXL。研究表明，SOX4/SMAD3調(diào)控AXL的表達(dá)，從而激活其下游致癌信號(hào)通路，最終促進(jìn)CML進(jìn)展。值得注意的是，AXL抑制劑Bemcentinib在體外和體內(nèi)均顯著抑制CML細(xì)胞的增殖和進(jìn)展。

受體酪氨酸激酶介導(dǎo)的信號(hào)通路受配體、受體及其下游效應(yīng)物共定位于脂筏/小窩蛋白-1富集的膜微域調(diào)控。膜受體AXL的功能依賴于與其配體GAS6的結(jié)合。骨髓來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞分泌的GAS6激活白血病細(xì)胞上的AXL，形成旁分泌調(diào)節(jié)環(huán)。因此，AXL的膜定位對(duì)于配體結(jié)合和信號(hào)通路激活至關(guān)重要。令人驚訝的是，研究發(fā)現(xiàn)敲低SOX4/SMAD3不僅降低了AXL的表達(dá)，還減少了其膜定位。膜受體的定位和信號(hào)活性受細(xì)胞膜生物物理特性的影響，包括曲率、電荷、序性、流動(dòng)性和結(jié)構(gòu)。

正如通路富集所提示的，SOX4/SMAD3調(diào)控脂質(zhì)代謝，特別是PC代謝。PC通過(guò)Kennedy途徑從頭合成，然后通過(guò)Lands循環(huán)進(jìn)行脫酰-再�；�重塑。Lands循環(huán)通過(guò)修飾脂肪酸飽和度和其他生化特征來(lái)有效地多樣化膜磷脂。Lands循環(huán)的再�；�階段由溶血磷脂酰膽堿酰基轉(zhuǎn)移酶LPCATs催化。研究證實(shí)，SOX4/SMAD3可以直接調(diào)控磷脂代謝的關(guān)鍵酶LPCAT1，從而改變膜中飽和磷脂的含量，重塑膜結(jié)構(gòu)、序性和流動(dòng)性。外源性過(guò)表達(dá)LPCAT1或補(bǔ)充其代謝產(chǎn)物DPPC（一種飽和PC），可以逆轉(zhuǎn)AXL的內(nèi)化并恢復(fù)其膜定位。然而，SOX4和SMAD3可能還調(diào)控LPCAT1以外的膜磷脂重塑通路，例如調(diào)控影響膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)的SLC44A2，調(diào)控影響PC在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜之間運(yùn)輸?shù)腟TARD10和PCTP。這些局限性是未來(lái)需要突破和解決的方面。

本研究鑒定了一個(gè)由SOX4/SMAD3協(xié)同驅(qū)動(dòng)的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。具體而言，SOX4和SMAD3不僅直接調(diào)控AXL的表達(dá)，還通過(guò)調(diào)控LPCAT1介導(dǎo)的膜磷脂重塑來(lái)影響AXL的膜定位和激活，這兩者在CML的進(jìn)展中都扮演著重要角色。這些發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)了我們對(duì)CML轉(zhuǎn)化過(guò)程中轉(zhuǎn)錄失調(diào)的理解，并提供了潛在的治療策略。