1 引言

氮是植物生長發(fā)育不可或缺的必需元素。硝態(tài)氮是陸地作物主要吸收的氮源形式。液泡作為細胞內(nèi)的主要儲庫，儲存了細胞內(nèi)約90%的硝態(tài)氮，對于調(diào)節(jié)細胞質(zhì)硝態(tài)氮穩(wěn)態(tài)和氮素再分配至關(guān)重要。位于液泡膜上的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白和通道負責(zé)將過量的硝態(tài)氮泵入液泡儲存，并在氮素缺乏時釋放出來。在模式植物擬南芥中，AtCLCa是研究最為深入的液泡硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白之一，它以2NO₃^-/1H⁺反向轉(zhuǎn)運體的形式，介導(dǎo)硝態(tài)氮向液泡內(nèi)轉(zhuǎn)運。然而，對于AtCLCa等轉(zhuǎn)運蛋白的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，尤其在作物中，仍然知之甚少。

植物通過復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)感知和響應(yīng)硝酸鹽變化。質(zhì)膜定位的雙重親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白/感受器NRT1.1與細胞內(nèi)的硝酸鹽響應(yīng)因子NLP構(gòu)成硝酸鹽信號傳導(dǎo)的核心通路。此外，bHLH家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，參與調(diào)控多種生理過程。近年來有研究報道bHLH轉(zhuǎn)錄因子通過與NLP蛋白互作參與硝酸鹽信號調(diào)控。然而，bHLH轉(zhuǎn)錄因子是否以及如何調(diào)控液泡膜硝酸鹽轉(zhuǎn)運，在很大程度上仍是未知的。

本研究揭示了一個新的調(diào)控機制，即玉米bHLH轉(zhuǎn)錄因子ZmbHLH118通過直接抑制液泡硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因ZmCLCa的表達，負向調(diào)控玉米植株生長和硝態(tài)氮含量，進而影響氮素利用效率和田間籽粒產(chǎn)量。

2 結(jié)果

2.1 ZmbHLH118負調(diào)控玉米生長和硝酸鹽含量

研究者篩選到一個bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因ZmbHLH118的過表達株系。在正常硝酸鹽條件下，ZmbHLH118過表達植株表現(xiàn)出顯著的生長抑制，地上部和根部生物量降低，硝態(tài)氮和總氮含量也顯著下降，這種效應(yīng)在根部更為明顯。相反，一個EMS誘導(dǎo)的zmbhlh118-ems突變體在正常硝酸鹽條件下比野生型生長得更好，生物量更高，但硝態(tài)氮和總氮含量無顯著差異。這些數(shù)據(jù)表明ZmbHLH118負調(diào)控玉米植株的生長和硝態(tài)氮含量。

2.2 ZmbHLH118具有轉(zhuǎn)錄抑制活性并對硝酸鹽波動有響應(yīng)

亞細胞定位實驗表明ZmbHLH118定位于細胞核。酵母轉(zhuǎn)錄活性分析顯示ZmbHLH118具有轉(zhuǎn)錄抑制活性。qRT-PCR分析表明，ZmbHLH118在幼苗期主要在根中高表達。同時，長期缺氮會顯著誘導(dǎo)ZmbHLH118的表達，而硝酸鹽復(fù)供后ZmbHLH118的表達會被短暫誘導(dǎo)，這表明其表達受硝酸鹽負調(diào)控。

2.3 ZmbHLH118過表達導(dǎo)致玉米轉(zhuǎn)錄組對硝酸鹽的響應(yīng)

對ZmbHLH118過表達植株根部的RNA-seq分析表明，在正常硝酸鹽條件下有大量差異表達基因，KEGG和GO富集分析顯示這些基因主要富集在氮代謝、離子轉(zhuǎn)運、陰離子轉(zhuǎn)運等通路。其中，一個編碼CLC家族蛋白的基因ZmCLCa表達下調(diào)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，ZmCLCa是擬南芥AtCLCa和AtCLCb最接近的同源物，并且像AtCLCa一樣，在其底物選擇性濾器的關(guān)鍵位置含有一個保守的脯氨酸殘基，這暗示其具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運功能。

2.4 ZmbHLH118直接結(jié)合ZmCLCa啟動子并負調(diào)控其表達

qRT-PCR實驗證實，在正常硝酸鹽條件下，ZmbHLH118過表達植株根中ZmCLCa轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，而zmbhlh118-ems突變體中ZmCLCa表達上調(diào)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻鳎琙mbHLH118可抑制由ZmCLCa啟動子驅(qū)動的熒光素酶活性。通過酵母單雜交、染色質(zhì)免疫共沉淀和電泳遷移率變動分析，研究者證實ZmbHLH118可直接結(jié)合到ZmCLCa啟動子區(qū)含有E-box基序的P3片段上。此外，與ZmbHLH118序列相似的其他三個bHLH成員（ZmbHLH162、ZmbHLH164、ZmbHLH172）也能抑制ZmCLCa啟動子活性，暗示可能存在功能冗余。

2.5 ZmCLCa定位于液泡膜且轉(zhuǎn)錄受硝酸鹽正調(diào)控

亞細胞定位實驗證實ZmCLCa定位于液泡膜。組織表達分析顯示ZmCLCa在根中高表達。與ZmbHLH118相反，硝酸鹽處理可顯著誘導(dǎo)ZmCLCa的表達，而缺氮則會抑制其表達。

2.6 ZmCLCa正調(diào)控玉米生長和硝酸鹽含量

利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建的zmclca敲除突變體在正常硝酸鹽條件下表現(xiàn)出生長抑制、生物量降低，以及硝態(tài)氮和總氮含量顯著下降，尤其是在根部。過表達ZmCLCa并未顯著改變植株的硝態(tài)氮和總氮含量。

2.7 ZmCLCa促進玉米根系硝酸鹽吸收和氯酸鹽抗性

利用¹⁵N標(biāo)記的硝酸鹽吸收實驗發(fā)現(xiàn)，zmclca敲除突變體和ZmbHLH118過表達植株的根部硝酸鹽吸收速率均顯著低于野生型。此外，zmclca突變體和ZmbHLH118過表達植株對毒性類似物氯酸鹽更加敏感，這表明ZmCLCa功能受損會影響液泡對硝酸鹽（或氯酸鹽）的裝載和解毒能力。

2.8 ZmCLCa介導(dǎo)硝酸鹽跨液泡膜轉(zhuǎn)運

為驗證ZmCLCa是否具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運功能，研究者在擬南芥clca-3突變體及煙草葉片中瞬時表達ZmCLCa并進行膜片鉗分析。結(jié)果表明，表達ZmCLCa的液泡表現(xiàn)出與AtCLCa類似的離子電流特性，證明ZmCLCa能夠介導(dǎo)硝酸鹽跨液泡膜向液泡內(nèi)轉(zhuǎn)運。

2.9 ZmbHLH118和ZmCLCa調(diào)控田間玉米生長與產(chǎn)量

田間試驗表明，ZmbHLH118過表達植株和zmclca敲除突變體株高降低、果穗變小、單株產(chǎn)量顯著下降。這些結(jié)果說明ZmbHLH118和ZmCLCa在調(diào)控玉米田間產(chǎn)量和氮素利用效率方面扮演重要角色。

2.10 ZmbHLH118對ZmCLCa的調(diào)控位于ZmNRT1.1B介導(dǎo)的硝酸鹽信號下游但不依賴于ZmNLP3

硝酸鹽感應(yīng)和信號傳導(dǎo)主要由質(zhì)膜定位的感受器ZmNRT1.1B和胞內(nèi)感應(yīng)器ZmNLP3等介導(dǎo)。實驗發(fā)現(xiàn)，在zmnrt1.1b突變體中，硝酸鹽對ZmCLCa的上調(diào)作用和對ZmbHLH118的抑制作用均被削弱。然而，ZmCLCa的表達在zmnlp3.1突變體中未受影響，且ZmNLP3.1不影響ZmCLCa啟動子活性。這表明ZmbHLH118-ZmCLCa模塊位于ZmNRT1.1B介導(dǎo)的硝酸鹽信號通路下游，但獨立于ZmNLP3。

3 討論

本研究在玉米中發(fā)現(xiàn)了一個新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模塊：ZmbHLH118-ZmCLCa。ZmbHLH118作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，在響應(yīng)外界硝酸鹽信號時，直接結(jié)合并抑制液泡膜硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因ZmCLCa的表達。ZmCLCa是擬南芥AtCLCa/AtCLCb的功能同源物，定位于液泡膜，負責(zé)將硝態(tài)氮從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運至液泡儲存。功能缺失的zmclca突變體或過表達ZmbHLH118均會導(dǎo)致植株硝酸鹽吸收和儲存能力下降，生長受阻，最終影響田間產(chǎn)量。這一發(fā)現(xiàn)揭示了液泡硝酸鹽裝載的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，為理解植物細胞內(nèi)硝酸鹽穩(wěn)態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了新視角。同時，鑒定出的ZmbHLH118和ZmCLCa基因為通過基因工程手段改良玉米等作物的氮素利用效率提供了有價值的候選靶標(biāo)。

4 方法

研究使用了玉米自交系B73和ND101等材料。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建了ZmbHLH118過表達、zmclca、zmnrt1.1b、zmnlp3.1的CRISPR/Cas9敲除突變體，并利用EMS誘變獲得了zmbhlh118-ems和zmclca-ems點突變體。研究綜合運用了分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、生理學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、雙熒光素酶報告基因、酵母單雜交、染色質(zhì)免疫共沉淀、電泳遷移率變動分析、膜片鉗電生理以及田間表型分析等多種技術(shù)手段來驗證假設(shè)。