數字生物分析技術因其單分子水平的檢測能力，已成為疾病早期診斷領域的關鍵技術。然而，傳統的數字分析方法（如Simoa和ddPCR）依賴于精密的密封微室制造、復雜的終點熒光信號讀取以及高端設備，限制了其在中心實驗室以外的廣泛應用。此外，基于微珠的非密封數字策略也嚴重依賴終點熒光檢測，需要酶催化或核酸信號放大反應來確保單個靶分子產生足夠強的熒光信號，且成像時信號易丟失，影響檢測效率。

與此不同，本文提出了一種新型的人工智能（AI）輔助實時數字微電機追蹤免疫分析（AI-dMIA）。該方法以蛋白質生物標志物為模型分析物，利用自主開發的多微粒追蹤系統（MTS）實時監測微電機的運動軌跡，從而實現數字化的蛋白質分析。在這一設計中，即使是在完全開放的微粒表面發生單個分子橋聯的免疫結合事件，也能誘導產生明顯的運動行為和軌跡，形成一個可被明場顯微鏡結合AI算法實時準確追蹤并與陰性微粒區分的陽性微電機。

該設計以磁驅動為例。首先，用捕獲抗體功能化的聚苯乙烯微球（直徑6 μm，記為PS₆）作為完全開放的載體來捕獲目標分子。當目標蛋白數量遠少于PS₆時，每個PS₆上遵循泊松分布僅捕獲1個或0個蛋白分子。攜帶一個蛋白分子的PS₆會與生物素標記的檢測抗體發生夾心免疫反應。隨后，引入鏈霉親和素-多聚HRP（SA-polyHRP），通過酪酰胺信號放大（TSA）在攜帶目標蛋白的PS₆上催化沉積大量生物素-酪胺，從而捕獲大量的SA標記的磁性納米粒子（直徑50 nm，記為MNPs₅₀）到PS₆上，形成PS₆-MNPs₅₀磁性微電機。相反，無目標的PS₆不會被沉積MNPs₅₀。然后，將所有PS₆浸入密度高于PS₆的測試液體介質中，以確保PS₆保持漂浮狀態，從而大大降低其運動阻力。在固定外部磁場作用下，所有PS₆的運動軌跡可通過普通明場顯微鏡記錄，并使用MTS進行大規模實時軌跡跟蹤分析。因此，由單個分子免疫反應誘導的PS₆-MNPs₅₀會沿磁場方向表現出明顯運動，從而被MTS識別為陽性電機；而僅顯示不規則布朗運動的MNPs₅₀-free PS₆則被標記為陰性。

準確、實時的微電機追蹤是AI-dMIA概念的基礎。自主編寫的MTS系統將多微粒識別和軌跡追蹤整合到一個一體化工作流中，能夠很好地應對大規模同時追蹤數千個軌跡的挑戰。其算法框架具體包括：通過切片輔助超推理（SAHI）將運動視頻分割成大量重疊的圖像塊，并結合YOLOv11進行目標識別。隨后使用Otsu自適應閾值分割量化目標像素覆蓋率，并基于單個PS₆的面積，利用核密度估計（KDE）統計評估每個目標中單PS₆的數量，從而實現精確計數。之后，簡單的在線實時追蹤（SORT）算法處理連續幀的識別結果以實現跨幀關聯，從而支持數千個目標的實時、大規模軌跡追蹤。最后，通過設定閾值獲得陽性電機數量、陽性電機百分比（PPM）以及僅包含陽性電機的軌跡標記視頻。

6；(III) 使用ImageJ識別PS₆。(d) ImageJ和MTS分別處理的總目標數和單PS₆數的比較。(e) MTS分析不同時期的總PS₆識別和陽性電機的軌跡長度。">

經過訓練，YOLOv11模型顯示出高識別精度，平均精度達到97.76%。MTS的追蹤有效性通過測試完整視頻序列得到驗證，達到了92.72%的多目標追蹤準確度（MOTA）。與ImageJ相比，MTS在單PS₆分辨計數識別方面表現出更優的能力，因為它可以自動將聚集體分割為單個PS₆進行計數并分別追蹤其軌跡。在實際工作流程中，隨著時間的推移，陽性電機沿磁場方向的軌跡逐漸變長。這些結果表明，自主編寫的MTS具有優異的識別和追蹤精度。

以前列腺特異性抗原（PSA）作為模型生物標志物，評估了AI-dMIA的可行性和分析性能。首先，通過分析純PS₆樣品的布朗運動行為來設定區分陽/陰性電機的閾值。閾值設定為所有純PS₆的平均運動速度加上10倍標準差。當PS₆沿期望方向的運動速度大于設定閾值時，被識別為陽性電機（1）；反之則為陰性（0）。此設置可確保幾乎所有純PS₆都被識別為陰性。當系統中僅添加PS₆和MNPs₅₀而不添加PSA（空白）時，僅檢測到可忽略不計的陽性電機，這歸因于抗體對之間不可避免的弱非特異性吸附。然而，當向AI-dMIA系統中加入200 fg/mL PSA時，顯著的陽性電機展現出明顯的運動行為和軌跡，可以與陰性電機清晰區分，證明了所提出AI-dMIA的可行性。

6（a）、以及添加了0（空白，b）和200 fg/mL（c）PSA的傳感系統。">

在最優條件下，通過檢測一系列稀釋的PSA來研究AI-dMIA的分析性能。隨著PSA濃度從10 fg/mL上升到3 pg/mL，陽性電機數量和PPM逐漸增加。低至10 fg/mL的PSA可以與空白對照清晰區分。通過繪制PPM與PSA濃度（0.01至3 pg/mL）之間的關系，獲得了極佳的線性曲線，回歸方程為 PPM= 9.91 C_PSA(pg/mL) + 1.23，相關系數R²為0.9990。該方法的重復性通過在不同日期測試400 fg/mL PSA進行評估，顯示出優異性能。

此外，該方法還擴展到量化肝細胞生物標志物甲胎蛋白（AFP）和阿爾茨海默病相關蛋白Tau，以研究其普適性。與PSA分析類似，設定相同的閾值來區分陽性和陰性電機。隨著AFP和Tau濃度升高（AFP為0.04–8 pg/mL，Tau為0.01–6 pg/mL），陽性電機數量和PPM穩步上升，AFP和Tau的最低測定劑量分別為40 fg/mL和10 fg/mL，表明該方法具有優異的普適性。通過選擇幾種潛在的干擾蛋白來評估所提出AI-dMIA的特異性。結果顯示，只有添加了PSA的樣品能表現出沿磁場方向的明顯運動。由AFP、癌胚抗原（CEA）、Tau和心肌肌鈣蛋白I（cTnI）產生的PPM均可忽略不計，表明該方法具有高特異性。同型對照抗體的驗證結果也支持這一結論。通過測試26份臨床血清樣本（15份來自前列腺癌患者，11份來自健康個體）探索了該方法的實用性。AI-dMIA結果顯示，癌癥患者的PSA水平明顯高于健康個體，與醫院結果一致，表明該策略在真實復雜樣本中監測目標蛋白方面具有巨大潛力。

目前，現有的數字免疫分析主要采用終點檢測模式，在整個信號生成/放大反應過程完成后靜態計數陽性/陰性實體。為了證明實時數字信號方式的優越性，研究嘗試通過終點磁分離分析相同的反應系統。結果表明，通過磁分離方式，4 pg/mL PSA誘導的PS₆-MNPs₅₀數量才勉強能與空白對照區分，遠高于AI實時數字信號方式（10 fg/mL）。這是因為在低豐度PSA下，每個PS₆表面僅通過單個分子免疫結合事件連接了極少量MNPs₅₀，導致磁力不足以抵抗磁分離和洗滌。研究還設計了一種使用雙槽連接芯片的終點計數策略，但由于液流干擾，同樣無法通過簡單計數反映實際目標蛋白濃度。相比之下，AI-dMIA避免了磁分離和純化步驟，能夠精確區分即使由一個單分子免疫結合事件形成的PS₆-MNPs₅₀與純PS₆，表明AI實時數字信號方式優于終點信號讀出途徑。

6-MNPs₅₀的明場圖像。(c) 使用雙槽連接芯片進行PSA分析的終點檢測模式。(d) 不同PSA濃度（0, 40, 100, 400, 和 1000 fg/mL）驅動的右槽中PS₆的明場圖像。(e-h) TSA在AI-dMIA中的關鍵作用。(e) 使用PS₆和Ab2-MNP₅₀在AI實時數字信號方式下進行無TSA的一步免疫測定。(f) (e)中不同PSA劑量誘導的陽性電機數量。(g) 使用PS₆和Ab2-MNP₃₀₀在AI實時數字傳感方式下進行無TSA的一步免疫測定。(h) (g)中不同PSA濃度誘導的陽性電機數量。">

在所提出的AI-dMIA中，TSA是將足夠多的MNPs₅₀引入單分子結合位點以形成活性微電機的關鍵。如圖5e所示，使用一步單分子免疫反應，每個靶標只能與一個Ab2-MNP₅₀結合。然而，由于MNPs₅₀尺寸小、磁性弱，在低靶標濃度下無法實現數字方式區分。只有當靶標濃度高于10 pg/mL時，才會出現明顯的運動差異。即使使用磁性響應更強的MNPs₃₀₀進行一步單分子免疫反應，其分析性能仍不如TSA-MNPs₅₀方案。此外，使用MNPs₃₀₀代替MNPs₅₀執行AI-dMIA也能達到類似的傳感性能。因此，TSA在保證所提出AI-dMIA的靈敏度方面起著關鍵作用，無法通過使用大尺寸MNPs來替代。

本研究中的AI-dMIA設計使用PS₆作為微電機載體進行演示。實際上，更小的PS基微電機會表現出更快的運動速度，可能更容易且精確地從陰性純PS中區分出來。為了驗證這一點，研究比較了3 μm PS（PS₃）和0.5 μm PS（PS_0.5）在AI-dMIA中的運動軌跡。具體而言，使用Ab2-MNP₃₀₀通過一步夾心免疫測定測試PS₆、PS₃和PS_0.5，每組添加的PSA分子數與相應的PS數量相同。它們與空白對照和PSA處理后的運動軌跡如圖所示。空白對照組中電機的軌跡相似，均保持原位布朗運動。相反，靶標誘導的不同尺寸微電機的軌跡顯示出明顯差異。PS_0.5的軌跡是三組PS中最長的，而PS₆的最短。此外，在PS_0.5組中，由空白和PSA誘導的軌跡之間的差異也最為顯著。這些結果表明，所使用的PS直徑越小，獲得的結果可能越明顯。然而，值得注意的是，直徑約500 nm的PS很難使用普通明場顯微鏡精確監測。因此，在大多數傳感場景中，相對較大尺寸的顆粒（如PS₆和PS₃）即可滿足要求。特別是，通過利用熒光標記的PS和熒光顯微鏡，亞微米尺寸的熒光PS也可以完美地與AI輔助的MTS結合，實現陽性和陰性電機的精確區分，這在即時數字分析方面展現出巨大潛力。

300對PS₆(a)、PS₃(b) 和 PS_0.5(c) 進行一步夾心免疫反應，以及由空白對照和PSA誘導的軌跡。(d) PS₆、PS₃和PS_0.5由空白對照和PSA誘導的運動軌跡比較。">

總而言之，本文提出了一種創新的AI-dMIA，它利用AI輔助的MTS實時追蹤微電機運動軌跡，以數字方式超靈敏地量化目標蛋白。在該設計中，微電機受限靶標負載位點上的單分子結合事件可以誘導獨特的運動軌跡，并用作陽性信號；強大的MTS能夠同時追蹤數千個運動軌跡，以實時區分陽性和陰性事件。憑借其獨特設計，AI-dMIA不僅表現出優異的傳感性能（在靈敏度、時間成本和數字動態范圍方面與Simoa相似），而且避免了傳統終點數字生物檢測所必需的復雜操作、特殊試劑以及高端設備的要求。

同時值得指出的是，AI-dMIA在當前階段也存在一些不足。例如，它依賴明場顯微鏡來成像和記錄微電機運動軌跡，盡管方便且在普通實驗室普及，但在通量和小尺寸顆粒（如亞微米顆粒）方面存在局限。此外，該方法中使用的懸浮系統需要與微球的材料和尺寸兼容，且在不同實驗環境中校準閾值是不可避免的。因此，研究希望開發標準設備以提高AI-dMIA的通量，并進一步將其與熒光顯微鏡結合，用于基于一步結合的簡單數字檢測。如果這些問題能夠得到妥善解決，這項提出的AI-dMIA可能為設計微電機數字生物檢測開辟新方向，推動痕量生物標志物分析的發展。

（此部分詳細描述了研究所用的材料與試劑、捕獲抗體偶聯PS₆的制備、AI-dMIA的典型步驟、血清樣本中PSA水平的測定、使用PS₆和Ab2-MNP₃₀₀的一步夾心免疫測定步驟、使用PS₆和MNPs₃₀₀的AI-dMIA步驟、測試溶液配方以及統計分析方

法。）