細(xì)胞與基因療法正在徹底改變癌癥的治療方式。雖然嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞療法在治療晚期白血病和淋巴瘤方面取得了顯著成功，但其在實(shí)體瘤中的應(yīng)用面臨更大挑戰(zhàn)。高達(dá)90%的成人癌癥為實(shí)體瘤，其預(yù)后通常較差。實(shí)體瘤的腫瘤微環(huán)境（TME）復(fù)雜，具有營養(yǎng)匱乏、高酸性和缺氧等免疫抑制特征，這使得浸潤的免疫細(xì)胞（包括T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞）功能受損。自然殺傷（NK）細(xì)胞作為先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞毒性細(xì)胞，具有無需預(yù)先致敏即可快速識(shí)別和清除腫瘤細(xì)胞的獨(dú)特優(yōu)勢，且安全性更佳，具備同種異體治療的潛力。然而，實(shí)體瘤TME中的缺氧成為了NK細(xì)胞療法有效性的主要障礙。缺氧源于癌細(xì)胞的快速增殖、代謝改變以及紊亂的血管系統(tǒng)，導(dǎo)致氧氣分壓陡降。臨床上，缺氧與多種實(shí)體瘤的不良預(yù)后相關(guān)，并嚴(yán)重影響包括NK細(xì)胞療法在內(nèi)的免疫治療效果。因此，理解缺氧如何塑造NK細(xì)胞生物學(xué)對于優(yōu)化其在實(shí)體癌中的免疫治療應(yīng)用至關(guān)重要。

免疫細(xì)胞的代謝遠(yuǎn)不止于ATP生成和生物合成，需要協(xié)調(diào)的代謝途徑來支持特定的效應(yīng)功能。線粒體已成為NK細(xì)胞代謝和適應(yīng)性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，其結(jié)構(gòu)深刻影響NK細(xì)胞在癌癥和慢性感染中的反應(yīng)。功能失調(diào)的NK細(xì)胞通常表現(xiàn)為小型、碎片化的線粒體，這突顯了線粒體動(dòng)力學(xué)作為潛在代謝干預(yù)靶點(diǎn)的重要性。胞質(zhì)GTP酶動(dòng)力相關(guān)蛋白1（DRP1）是線粒體分裂的主要介導(dǎo)者。在細(xì)胞壓力下，失調(diào)的DRP1活性會(huì)促進(jìn)過度的線粒體碎片化、線粒體功能障礙、活性氧（ROS）水平升高和細(xì)胞適應(yīng)性的喪失。這些特征表明，調(diào)節(jié)DRP1依賴的線粒體動(dòng)力學(xué)可能恢復(fù)NK細(xì)胞在缺氧腫瘤微環(huán)境中的功能。

本研究旨在探究缺氧對NK細(xì)胞（包括細(xì)胞因子武裝的第四代CAR NK細(xì)胞）的影響，證實(shí)缺氧損害NK細(xì)胞線粒體功能和細(xì)胞毒性效應(yīng)潛力，并驗(yàn)證基因敲除DRP1能否在代謝壓力下保護(hù)NK細(xì)胞功能。

為理解低氧如何改變NK細(xì)胞代謝和細(xì)胞毒性，研究采用1% O₂培養(yǎng)NK細(xì)胞48小時(shí)以模擬TME缺氧水平。結(jié)果顯示，缺氧顯著削弱了NK細(xì)胞對K562靶細(xì)胞的殺傷活性。在代謝層面，缺氧暴露48小時(shí)后，NK細(xì)胞的總線粒體含量顯著減少，而細(xì)胞體積未變。線粒體膜電位（線粒體活性的指標(biāo)）顯著降低，同時(shí)線粒體ROS水平強(qiáng)烈升高，這些均指向缺氧培養(yǎng)引起的線粒體應(yīng)激。

RNA測序分析揭示了缺氧NK細(xì)胞獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄譜。與預(yù)期一致，缺氧暴露的NK細(xì)胞表現(xiàn)出缺氧標(biāo)志基因的顯著富集。相反，與mTORC1信號、干擾素反應(yīng)和氧化磷酸化相關(guān)的基因顯著下調(diào)，而線粒體動(dòng)力學(xué)和監(jiān)測基因上調(diào)。mTORC1信號在調(diào)節(jié)NK細(xì)胞代謝和效應(yīng)功能中起核心作用，干擾素反應(yīng)對于免疫監(jiān)視和細(xì)胞毒性至關(guān)重要。氧化磷酸化相關(guān)基因的下調(diào)與觀察到的線粒體含量和膜電位降低一致。上調(diào)的“線粒體動(dòng)力學(xué)和監(jiān)測”轉(zhuǎn)錄特征突出了缺氧NK細(xì)胞中的線粒體應(yīng)激反應(yīng)，其特點(diǎn)是調(diào)控分裂、融合、凋亡和線粒體自噬的基因表達(dá)增加。此外，缺氧NK細(xì)胞顯示出抗氧化活性降低的趨勢，這與觀察到的線粒體ROS增加相符。

功能代謝分析（SCENITH?）顯示，缺氧導(dǎo)致對照組細(xì)胞中嘌呤霉素MFI降低約4.5倍，表明全局蛋白質(zhì)翻譯（及ATP產(chǎn)生）受到顯著抑制。盡管未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，但缺氧下糖酵解能力和葡萄糖依賴性增加，而線粒體依賴性降低，這反映了缺氧條件下以犧牲線粒體呼吸為代價(jià)的糖酵解適應(yīng)。這些觀察表明，缺氧給NK細(xì)胞帶來了顯著的代謝和生存壓力，導(dǎo)致線粒體功能障礙和功能損傷。

盡管NK細(xì)胞具有內(nèi)在的抗腫瘤活性，但通常需要細(xì)胞因子武裝的CAR工程來最大化抗癌療效，特別是在實(shí)體瘤中，通過增強(qiáng)靶向特異性和持久性。研究先前表明，IL-15與CD70導(dǎo)向的CAR共表達(dá)能夠在體外和體內(nèi)對血液和實(shí)體瘤模型產(chǎn)生強(qiáng)大的抗腫瘤活性。由于已知IL-15支持NK細(xì)胞代謝適應(yīng)性，研究探討了這些CAR工程細(xì)胞是否能抵御缺氧應(yīng)激。

通過分析癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)，評估了多種腫瘤類型的缺氧程度。許多腫瘤類型表現(xiàn)出升高的缺氧評分。基于TCGA數(shù)據(jù)和選定腫瘤實(shí)體已確立的缺氧微環(huán)境，研究選擇了具有代表性的腫瘤細(xì)胞系面板用于體外建模。

研究生成了CD70-CAR-IL-15 NK細(xì)胞，并證實(shí)了所有三種靶癌細(xì)胞系上CD70的高表面表達(dá)。在共培養(yǎng)前，將CAR NK細(xì)胞在常氧或缺氧條件下預(yù)處理48小時(shí)。結(jié)果顯示，缺氧顯著降低了CD70-CAR-IL-15 NK細(xì)胞介導(dǎo)的對所有靶細(xì)胞的殺傷。抑制作用在Raji和HeLa細(xì)胞中最為顯著，而對Panc-1細(xì)胞的影響較為溫和。這些結(jié)果表明，即使在IL-15的支持下，缺氧也會(huì)對血液和實(shí)體瘤細(xì)胞系中抗原特異性CAR NK細(xì)胞的功能產(chǎn)生抑制作用。

鑒于缺氧損害線粒體含量和功能，同時(shí)增強(qiáng)線粒體動(dòng)力學(xué)，且CD70-CAR-IL-15工程未能恢復(fù)細(xì)胞毒性，研究接下來探究了抑制分裂因子DRP1能否減輕NK細(xì)胞功能障礙。研究使用了DRP1抑制劑Mdivi-1。通過Mdivi-1處理阻斷該分裂因子，確實(shí)恢復(fù)了缺氧下對K562的殺傷，并防止了線粒體含量的損失。然而，該小分子的特異性受到質(zhì)疑，且其臨床應(yīng)用因缺乏安全性數(shù)據(jù)而受限。

為克服這些限制，研究利用CRISPR-Cas9技術(shù)實(shí)現(xiàn)了DRP1基因的穩(wěn)定敲除。通過使用預(yù)組裝的Cas9蛋白和靶向外顯子4的多向?qū)�RNA策略，實(shí)現(xiàn)了高且持久的敲除效率，并通過流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)DRP1^KONK細(xì)胞的磷酸化DRP1水平顯著降低。重要的是，DRP1缺失保持了NK細(xì)胞與野生型對照相當(dāng)?shù)脑鲋乘俾省Ｒ虼耍�盡管DRP1與缺氧誘導(dǎo)的NK細(xì)胞線粒體和功能損傷有關(guān)，但其缺失并不損害細(xì)胞活力或增殖能力。

首先評估了DRP1^KO細(xì)胞在缺氧下的線粒體占有率。DRP1^KONK細(xì)胞在缺氧條件下保持了線粒體完整性，其線粒體占有率維持在與常氧相當(dāng)?shù)乃�平。線粒體膜電位在缺氧下保持穩(wěn)定，而線粒體ROS水平在缺氧下仍然升高。

接下來研究了DRP1^KO細(xì)胞在缺氧和常氧條件下的轉(zhuǎn)錄和代謝譜。基因表達(dá)譜和排名前位的上、下調(diào)標(biāo)志通路與常氧 vs 缺氧條件下的DRP1^WT細(xì)胞相似，MIR142HG和BAX仍然是缺氧DRP1^KONK細(xì)胞中上調(diào)最強(qiáng)的基因。然而，mTORC1標(biāo)志通路和線粒體動(dòng)力學(xué)特征是顯著的例外。mTORC1通路在缺氧DRP1^WTNK細(xì)胞中下調(diào)，但在相同條件下的DRP1^KO細(xì)胞中似乎未改變。考慮到mTORC1在NK細(xì)胞效應(yīng)功能中的作用，這可能預(yù)示著殺傷能力的保持。此外，雖然線粒體動(dòng)力學(xué)特征在DRP1^WTNK細(xì)胞中顯著上調(diào)，但在DRP1^KONK細(xì)胞中情況并非如此，這與未改變的線粒體負(fù)荷一致。抗氧化活性的基因特征在缺氧下有下調(diào)趨勢，與觀察到的線粒體ROS水平升高一致，類似于DRP1^WTNK細(xì)胞。

為確定DRP1缺失是否改變NK細(xì)胞對缺氧的代謝反應(yīng)，研究對在常氧和缺氧條件下培養(yǎng)的DRP1^KO細(xì)胞進(jìn)行了SCENITH?分析。與野生型細(xì)胞相似，DRP1^KONK細(xì)胞在缺氧下顯示出翻譯和ATP產(chǎn)生的減少。有趣的是，盡管RNA-seq數(shù)據(jù)顯示OXPHOS相關(guān)基因下調(diào)，但SCENITH?顯示缺氧下線粒體依賴性增加，這與在DRP1^KO細(xì)胞中觀察到的線粒體膜電位和線粒體含量得以保持一致。總體而言，DRP1^KONK細(xì)胞在缺氧條件下保持了線粒體含量、膜電位和mTORC1信號，支持了其抵抗缺氧誘導(dǎo)功能障礙的潛力。

為評估DRP1^KONK細(xì)胞保持的線粒體完整性是否轉(zhuǎn)化為改善的效應(yīng)功能，研究對這些細(xì)胞進(jìn)行了改造，使其表達(dá)CD70-CAR-IL-15構(gòu)建體，并在缺氧條件下評估了它們的細(xì)胞毒性潛力。DRP1^KOCAR NK細(xì)胞在所有三種測試的腫瘤細(xì)胞系中都保持了強(qiáng)大的細(xì)胞毒性效應(yīng)功能，與常氧相比，在缺氧下未見損傷。

為進(jìn)一步在更生理相關(guān)的背景下評估其功能，研究建立了由胰腺導(dǎo)管腺癌患者來源類器官與CD70⁺癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞組成的3D微腫瘤模型。該模型更好地復(fù)現(xiàn)了TME的細(xì)胞復(fù)雜性，并允許評估患者特異性反應(yīng)。在三個(gè)測試患者樣本中的一個(gè)中，DRP1^KOCAR NK細(xì)胞顯著降低了綠色CAF信號，而DRP1^WTCAR NK細(xì)胞和無NK對照組則無此效果。在來自另外兩名患者的微腫瘤中，未觀察到對DRP1^WT和DRP1^KOCAR NK細(xì)胞反應(yīng)的顯著差異，其中一名患者表現(xiàn)出耐藥性，另一名表現(xiàn)出敏感性。

為探究不同患者的微腫瘤為何對CAR NK細(xì)胞反應(yīng)不同，研究對患者來源類器官進(jìn)行了RNA測序，以識(shí)別與CAR NK細(xì)胞活性相關(guān)的獨(dú)特轉(zhuǎn)錄腫瘤程序。患者1的類器官顯示上皮信號、缺氧和炎癥應(yīng)激以及TGF-β信號和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的富集，反映了一種TGF-β^高、EMT偏向的表型，這可能解釋了對DRP1^WT和DRP1^KOCAR NK細(xì)胞的完全耐藥。患者2的類器官顯示出增殖性和凋亡應(yīng)激特征，以及TGF-β/EMT特征，反映了一種應(yīng)激的腫瘤狀態(tài)，與強(qiáng)大的基礎(chǔ)NK細(xì)胞活性一致。患者3的類器官表現(xiàn)出強(qiáng)烈的糖酵解和代謝、增殖應(yīng)激以及缺氧和炎癥程序，定義了一種缺氧適應(yīng)、糖酵解表型。雖然這些微腫瘤對DRP1^WTNK細(xì)胞具有耐藥性，但能被DRP1^KONK細(xì)胞有效靶向，突顯了其對缺氧應(yīng)激的韌性。這些發(fā)現(xiàn)表明，患者來源類器官的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)定義了微腫瘤對CAR NK細(xì)胞的耐藥模式，突顯了在評估NK細(xì)胞療法時(shí)患者變異性的重要性。

缺氧是實(shí)體瘤的標(biāo)志，已知會(huì)損害包括NK細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞功能。與早期發(fā)現(xiàn)一致，本研究表明暴露于低氧水平會(huì)導(dǎo)致NK細(xì)胞細(xì)胞毒性降低。這種損傷也在用CD70靶向CAR和自分泌IL-15改造的NK細(xì)胞中觀察到。雖然CAR策略和細(xì)胞因子支持通常能增強(qiáng)NK細(xì)胞功能，但證明不足以完全抵消缺氧誘導(dǎo)的功能障礙。因此，這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)需要直接解決缺氧TME所施加的代謝限制的策略。

線粒體是細(xì)胞代謝和免疫細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器。它們不斷經(jīng)歷分裂和融合，重塑其結(jié)構(gòu)。由DRP1和FIS1介導(dǎo)的分裂促進(jìn)線粒體自噬、ROS產(chǎn)生、凋亡和細(xì)胞增殖。由MFN1、MFN2和OPA1控制的融合形成管狀網(wǎng)絡(luò)，增強(qiáng)氧化磷酸化，增加Ca2?流，并保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激。在人類腫瘤的缺氧區(qū)域，腫瘤浸潤NK細(xì)胞表現(xiàn)出DRP1活化增加，這由持續(xù)的mTOR信號驅(qū)動(dòng)。這導(dǎo)致線粒體碎片化、線粒體極化減少、線粒體ROS增加和細(xì)胞毒性受損，本研究的結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。

鑒于這一背景，以及缺氧NK細(xì)胞中線粒體代謝和含量的深刻變化，研究探討了靶向DRP1是否能保護(hù)NK細(xì)胞功能。研究結(jié)果表明，用Mdivi-1進(jìn)行DRP1的藥理抑制恢復(fù)了線粒體缺陷和細(xì)胞毒性。然而，出于對Mdivi-1特異性和患者安全性的擔(dān)憂，研究使用CRISPR-Cas9技術(shù)產(chǎn)生了穩(wěn)定的DRP1^KONK細(xì)胞。DRP1^KONK細(xì)胞在常氧下正常增殖，并在缺氧下保持細(xì)胞毒性潛力和線粒體含量。

盡管存在功能差異，但DRP1^KO和DRP1^WTNK細(xì)胞在缺氧下顯示出相似的轉(zhuǎn)錄譜。這可能部分反映了用于RNA-seq的較短缺氧暴露時(shí)間，該時(shí)間選擇是為了確保高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，與功能測定中使用的48小時(shí)暴露時(shí)間形成對比。一個(gè)顯著的轉(zhuǎn)錄差異是mTORC1信號的行為。雖然該通路在缺氧DRP1^WT細(xì)胞中下調(diào)，但在DRP1^KO細(xì)胞中基本保持不變。NK細(xì)胞的細(xì)胞因子刺激導(dǎo)致mTOR活化，這是代謝和功能反應(yīng)所必需的。在許多細(xì)胞類型中，缺氧會(huì)抑制mTORC1信號，通常涉及應(yīng)激反應(yīng)通路。雖然轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)符合這一普遍模式，但與先前研究中關(guān)于缺氧條件下NK細(xì)胞mTORC1激活增加的報(bào)道形成對比。造成這種差異的因素可能包括細(xì)胞類型、缺氧持續(xù)時(shí)間、培養(yǎng)條件以及評估m(xù)TORC1活性的特定讀數(shù)差異。盡管RNA-seq僅提供mTORC1信號的間接視圖，但在具有高mTORC1活性的細(xì)胞中觀察到了已建立的mTORC1反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄程序。在此背景下，在缺氧下觀察到的保持的mTORC1相關(guān)轉(zhuǎn)錄輸出可能有助于NK細(xì)胞功能的維持。

實(shí)體瘤中的氧氣可用性高度異質(zhì)，范圍從壞死核心內(nèi)的近缺氧條件到侵襲邊緣的輕度缺氧。研究使用慢性1% O₂來研究強(qiáng)烈且持續(xù)的腫瘤缺氧對NK細(xì)胞線粒體生物學(xué)和效應(yīng)功能的有害影響。由于體外缺氧暴露是靜態(tài)的，研究納入了PDAC患者來源的3D微腫瘤來近似空間氧氣梯度和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性。患者來源類器官之間的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性強(qiáng)烈預(yù)測了微腫瘤模型中CAF對CAR NK細(xì)胞的反應(yīng)。患者1表現(xiàn)出TGF-β/EMT和上皮-缺氧程序的富集，這是免疫排斥PDAC狀態(tài)的特征。TGF-β信號是肌成纖維樣CAF分化、細(xì)胞外基質(zhì)沉積和直接NK細(xì)胞抑制的核心驅(qū)動(dòng)因素，為觀察到的完全耐藥性提供了機(jī)制依據(jù)。患者2類器官顯示出增殖和凋亡應(yīng)激程序，這是一種與應(yīng)激配體表達(dá)增加和顆粒酶介導(dǎo)的細(xì)胞毒性易感性增強(qiáng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，推測導(dǎo)致了CAR NK細(xì)胞細(xì)胞毒性更許可的環(huán)境。患者3類器官顯示出強(qiáng)烈的糖酵解和缺氧特征，這些已知會(huì)通過乳酸積累、酸中毒和營養(yǎng)競爭產(chǎn)生代謝抑制微環(huán)境，損害免疫效應(yīng)細(xì)胞的線粒體功能。這些條件選擇性地使對缺氧誘導(dǎo)的線粒體碎片化敏感的DRP1^WTNK細(xì)胞失活，但被DRP1^KONK細(xì)胞克服，后者在缺氧應(yīng)激下保持線粒體適應(yīng)性。這些關(guān)聯(lián)依賴于類器官轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)，但支持了NK細(xì)胞線粒體動(dòng)力學(xué)和適應(yīng)性的重要性，這兩者都決定了免疫細(xì)胞的命運(yùn)和功能。這些發(fā)現(xiàn)表明，腫瘤內(nèi)在程序在決定CAR NK細(xì)胞療效方面起著決定性作用，突顯了將NK細(xì)胞工程策略與患者定義的耐藥狀態(tài)相匹配的重要性。盡管患者來源的體外模型允許納入這種患者異質(zhì)性，但它們?nèi)狈��?dòng)態(tài)的氧氣循環(huán)和完整的基質(zhì)多樣性。因此，最終需要相關(guān)的體內(nèi)模型來進(jìn)行具有轉(zhuǎn)化目的的細(xì)胞療法研究。總體而言，腫瘤氧氣限制在設(shè)汁能夠在患者腫瘤內(nèi)和腫瘤間的異質(zhì)性中始終如一地發(fā)揮作用的細(xì)胞療法方面，提出了額外的挑戰(zhàn)。

總之，研究結(jié)果表明缺氧對NK細(xì)胞代謝和功能產(chǎn)生廣泛影響，這無法通過細(xì)胞因子武裝的CAR完全挽救。數(shù)據(jù)還表明，線粒體動(dòng)力學(xué)是這一現(xiàn)象的核心，在NK細(xì)胞中破壞DRP1可以在缺氧下保護(hù)線粒體功能和細(xì)胞毒性效應(yīng)功能。這種線粒體調(diào)節(jié)可能是CAR NK細(xì)胞在實(shí)體癌中有效發(fā)揮作用所必需的。