特發性肺纖維化（IPF）是一種致死性間質性肺病，死亡率高，生存期短，臨床治療以延緩疾病進展為主，預防策略關注不足。本研究旨在探究天然黃酮類化合物槲皮素（QUE）對IPF的預防潛力及其機制。研究建立了博來霉素（BLM）誘導的小鼠和肺泡上皮細胞IPF模型，設置了兩個獨立的給藥窗口：預防性給藥（僅在BLM攻擊前）和治療性給藥（僅在BLM攻擊后）。研究結果揭示，預防性給QUE不僅能達到與治療后給藥相當的抗纖維化效果，還能更有效地抑制肺泡上皮損傷、鐵死亡和衰老的峰值。預防性方案還能加速GSH和GPx4水平的恢復。機制上，QUE在健康肺泡上皮細胞中觸發了一種適應性應激，表現為ROS輕度升高和氧化應激響應通路激活。這種應激對健康細胞的活力、增殖、克隆形成、凋亡或衰老影響甚微。相反，它通過14-3-3γ介導的磷酸化增強了NRF2的核轉位，從而驅動GSH和GPx4的持續升高，賦予細胞鐵死亡抗性，進而限制纖維化發生。關鍵性實驗發現，共施用Mito-TEMPO或Z-VAD-FMK可抑制QUE誘導的ROS，但同時會消除其對BLM損傷的預防作用，證實了通過適應性應激進行的“預適應”是QUE預防作用的核心機制。這些發現揭示了QUE作為一種有前景的IPF預防劑，其作用機制是通過肺泡上皮細胞的預適應來增強鐵死亡抗性。

IPF的病因不明，但普遍認為是肺泡上皮反復損傷的結果。持續損傷會損害肺泡祖細胞的分化和再生能力，并同時觸發TGF-β等促纖維化介質的分泌，從而導致肌成纖維細胞異常活化和上皮細胞向纖維化表型轉化。IPF患者支氣管肺泡灌洗液（BALF）中脂質過氧化產物水平升高，支持了鐵死亡在纖維化肺的細胞損傷中起重要作用。相應地，鐵死亡與肺中的上皮-間質轉化（EMT）和成纖維細胞-肌成纖維細胞轉化過程密切相關。因此，增強肺泡上皮細胞的鐵死亡抗性是預防IPF的一個有前景的策略。槲皮素（QUE）是一種天然黃酮類化合物，因其強大的抗氧化、抗炎和清除衰老細胞活性，已成為多種呼吸系統疾病有潛力的治療劑。然而，既往研究大多將QUE作為與肺損傷同時或之后給藥的“治療劑”進行評估，而非作為“預防性”措施。本研究旨在探究QUE的預防潛力，以誘導具有鐵死亡抗性的肺上皮穩態并保護其免受促纖維化損傷。

研究使用雌性C57BL/6小鼠和肺泡上皮細胞系（MLE-12）以及原代人氣道上皮細胞（HAECs）。動物實驗分為四組：正常對照組、BLM模型組、預防組（QUE + BLM）和治療組（BLM + QUE）。預防組小鼠在BLM暴露前4周每日腹腔注射QUE，并在BLM攻擊后停止給藥。治療組小鼠在BLM造模后第7天開始每日給予QUE，直至實驗結束。體外細胞實驗中，也設置了相應的預防性和治療性給藥方案。通過多種技術評估了纖維化程度、細胞損傷、氧化應激、鐵死亡和衰老等指標，包括組織學染色（Masson染色、天狼星紅染色、免疫組化/免疫熒光）、Western blot、ELISA、RNA測序（RNA-seq）、流式細胞術以及各類生化試劑盒檢測（羥脯氨酸、GSH/GSSG、MDA、4-HNE、Fe²⁺等）。

在小鼠中，預防性給QUE（BLM攻擊前4周開始，攻擊后停止）能顯著減輕BLM誘導的體重下降、肺組織羥脯氨酸水平升高以及肺纖維化（Masson和天狼星紅染色顯示）。同時，QUE預防性干預顯著降低了肺組織中TGF-β、Col I和α-SMA在蛋白和mRNA水平的表達。其抗纖維化效果與BLM損傷后開始給藥的“治療性”干預相當。此外，高表達α-SMA的纖維化肺實質區域常缺乏表達SPC的肺泡II型細胞，這與IPF源于肺泡損傷的經典觀點一致。

BLM攻擊后出現嚴重的肺泡上皮損傷，表現為肺泡I型（AT1）和II型（AT2）細胞大量耗竭。QUE預防顯著減少了BLM后第7天AT1和AT2的丟失，且這種保護作用持續到第28天。相比之下，QUE治療組小鼠在第7天經歷了更嚴重的上皮損傷，直到第28天才部分恢復。BLM誘導的急性肺泡損傷與氧化應激和鐵死亡有關。本研究發現，QUE預防在BLM后第7天就顯著減輕了肺組織ROS水平以及關鍵鐵死亡標志物（PTGS2、Fe²⁺、MDA、4-HNE）的升高，并增強了GSH/GSSG比值。這些保護作用持續到第28天。雖然QUE治療在第28天也能類似地減輕ROS和大多數鐵死亡標志物，但它未能恢復GPx4水平或GSH/GSSG比值，表明抗氧化防御系統的恢復效率較低。BLM誘導的損傷還加速了肺泡上皮衰老。QUE預防在第7天就顯著減輕了衰老標志物（p21、IL-6、IL-1β、TNF-α）的升高，并有效維持了抗炎因子IL-10的水平。這些數據表明，QUE預防通過增強肺泡上皮對BLM誘導的鐵死亡和衰老的抗性，從而減輕肺纖維化的發展。

在非衰老的對照細胞中，QUE僅引起最小的凋亡細胞數、caspase-3活化以及Bcl-2和Bax表達的變化，對衰老細胞流行率或衰老標志物p16和p21的表達影響甚微。這與QUE在輻射誘導的衰老細胞中觀察到的顯著促凋亡和清除衰老細胞效應形成對比。然而，QUE預處理顯著減輕了BLM在非衰老細胞中誘導的細胞活力變化和LDH釋放。這些數據表明，QUE對BLM損傷的預防效應不太可能是通過清除罕見的衰老細胞介導的，而是源于對占主導地位的健康細胞群體的直接預防機制。

RNA-seq分析顯示，QUE預處理的MLE-12細胞中，氧化應激響應通路被激活。與此一致，觀察到ROS水平中度升高（這與QUE在衰老細胞中的ROS清除作用相反）。然而，這種應激反應可能是適應性的，因為它并未對細胞形態、活力、群體倍增時間、克隆形成效率、凋亡或衰老產生有害影響。此外，轉錄組分析揭示了QUE誘導的NRF2轉錄活性和GSH代謝上調，以及GSH轉移酶和過氧化物酶活性增加。這在QUE預處理的MLE-12細胞中GSH水平升高和GSH/GSSG比值增加得到證實。考慮到QUE賦予鐵死亡抗性的作用，這些發現共同指向鐵死亡抑制因子GPx4，它利用GSH來解毒細胞毒性脂質過氧化物，并受NRF2轉錄調控。與此機制一致，研究證實了QUE預處理的MLE-12細胞中GSH含量以及GPx4在mRNA和蛋白水平的上調。關鍵的是，在QUE預防的小鼠肺中，GSH和GPX4的升高在QUE停藥后可持續4周，這表明這是一種不依賴于持續QUE暴露的持續生理狀態。

為驗證QUE誘導的應激與其對BLM損傷的預防效應之間的因果關系，用抗氧化劑Mito-TEMPO與QUE共處理MLE-12細胞。Mito-TEMPO有效減弱了QUE誘導的ROS，但同時消除了GSH和GPx4水平的增加，并損害了QUE的預防效應。鑒于QUE通過干擾抗凋亡/促生存通路誘導衰老細胞凋亡，推測其在健康非衰老肺泡細胞中也有類似相互作用。然而，在這些細胞中，QUE僅引發有限的應激，因為它們本身對抗凋亡通路的生存依賴較低。支持這一點的是，凋亡抑制劑Z-VAD-FMK與QUE共處理同樣減少了ROS誘導，并消除了GSH和GPx4水平的增加，其對BLM損傷的預防損害程度與Mito-TEMPO相當。此外，用H₂O₂預處理MLE-12細胞直接驗證了ROS介導的保護作用。中等劑量的H₂O₂（20 μM）產生的ROS水平與QUE相當，也能對隨后的BLM攻擊提供部分保護。而過高（100 μM）或不足（4 μM）的H₂O₂則無法提供保護。

研究發現，BLM暴露的小鼠肺中同時出現了14-3-3γ和GPx4水平的下降。在細胞水平，BLM以劑量和時間依賴的方式降低了MLE-12細胞中14-3-3γ的表達。QUE預防上調了MLE-12細胞中14-3-3γ的表達，并防止了其受BLM誘導的下降。功能缺失研究表明，敲低MLE-12細胞中的14-3-3γ顯著降低了GPx4水平，而用RSL3藥物抑制GPx4則未顯著改變14-3-3γ的表達。這些數據表明14-3-3γ位于GPx4的上游，對其調控至關重要。QUE預防增強了NRF2的磷酸化和核積累，并伴隨著胞質水平的降低。關鍵的是，這種QUE誘導的NRF2磷酸化和核轉位在14-3-3γ沉默的細胞中被消除。

BLM在MLE-12細胞中誘導的鐵死亡表現為GPx4表達顯著降低，鐵死亡標志物（PTGS2、Fe²⁺、MDA、4-HNE）水平升高，ROS/脂質ROS水平升高，以及GSH/GSSG平衡被破壞。這些鐵死亡變化在用QUE預處理或用鐵死亡抑制劑Fer-1處理的細胞中得到顯著緩解。至關重要的是，這種預防效應在14-3-3γ沉默后被消除，強調了14-3-3γ在介導QUE預防效應中不可或缺的作用。此外，BLM攻擊顯著上調了MLE-12細胞中的衰老標志物（p21和IL-1β）和纖維化標志物（TGF-β1、α-SMA和Col I）。Fer-1處理有效減輕了這些衰老和纖維化變化，暗示它們與鐵死亡相關。QUE預防同樣抑制了這些變化。一致的是，QUE預防的抗衰老和抗纖維化效應也在14-3-3γ沉默后顯著受損。

體外比較顯示，QUE預防和QUE治療均能顯著提高細胞活力并減少LDH釋放，兩種策略之間無統計學顯著差異。然而，RNA-seq分析揭示，在經受BLM攻擊的MLE-12細胞中，兩種QUE干預后的轉錄組譜相似，但存在細微差異。GO和WikiPathways富集分析表明，氧化應激響應、NRF2轉錄活性和GSH代謝通路在QUE預防的細胞中優先上調。與此一致，QUE預防能有效恢復BLM損傷后MLE-12細胞中14-3-3γ、GPx4和GSH的生理水平，而QUE治療則效果較弱。相比之下，QUE治療上調了涉及類二十烷酸脂質合成、鐵氧化酶活性、TGF-β信號傳導和肺纖維化通路的基因。這些發現表明，通過QUE治療從BLM攻擊中恢復的肺泡上皮細胞呈現出對鐵死亡和纖維化脆弱性增高的細胞狀態。

在HAECs中驗證了QUE的預防效應。與在MLE-12細胞中的觀察相似，QUE預處理在HAECs中誘導了ROS的輕度升高，并伴有GSH水平升高。在隨后的BLM攻擊中，QUE預處理的HAECs表現出顯著改善的細胞活力、LDH釋放、脂質ROS水平、GSH/GSSG比值和GPx4表達，同時纖維化表型變化得到緩解。

本研究采用明確的預防方案（在BLM攻擊前給QUE），證明QUE預防能有效限制肺泡上皮細胞丟失、鐵死亡和衰老水平的峰值，同時達到與常規QUE治療相當的抗纖維化效果。轉錄組和分子分析進一步揭示，與QUE治療相比，QUE預防能更優異地保存在BLM攻擊后存活的肺泡上皮細胞中的GPx4表達和GSH代謝。這表明細胞在應對進一步損傷時保留了抗氧化應激的能力。機制上，本研究排除了預防效應源于損傷峰值期藥物殘留或主要源于清除衰老細胞的可能性。相反，轉錄組分析和分子分析揭示，QUE在健康肺泡上皮細胞中誘導了ROS的輕度升高，這是一種與其在衰老細胞中ROS清除作用相反的促氧化效應。這種有限的應激可能源于QUE對抗凋亡通路的干擾。它沒有損害細胞核心特性，而是觸發了持續的反應，上調了GSH代謝和GPx4表達。我們認為這種持續反應是增強鐵死亡和纖維化抗性的基礎。QUE誘導的ROS與保護之間的因果關系得到證實，因為用Mito-TEMPO或Z-VAD-FMK共處理可逆轉QUE誘導的ROS、GSH和GPx4增加，并同時消除對BLM的抗性。這種ROS依賴的預適應機制可能不僅限于QUE，因為精細滴定過的H₂O₂預處理也能對BLM提供部分保護。研究進一步確定14-3-3γ是QUE預防的關鍵介質。QUE誘導14-3-3γ上調，進而促進NRF2磷酸化和核轉位，從而增強GSH合成和GPx4表達。至關重要的是，QUE對BLM誘導的鐵死亡、衰老和纖維化發生的預防效應在14-3-3γ沉默的肺泡上皮細胞中被消除。最后，在原代HAECs中，QUE也一致地提高了輕度ROS和GSH，并賦予了對BLM誘導的鐵死亡和促纖維化表型轉變的預防。

本研究結果證明了QUE在肺纖維化小鼠模型中的預防功效，并闡明了其在健康肺泡上皮細胞中被低估的促氧化作用，這是其預防作用的核心。這些發現拓展了QUE的藥理功能，使其成為一種“抗氧化疫苗”：它啟動了適應性氧化應激反應，在肺泡上皮細胞中誘導出一種鐵死亡抗性狀態，從而減輕纖維化發生的易感性。