食管癌是全球癌癥相關死亡的主要原因之一，其中食管鱗狀細胞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma, ESCC）占全球食管癌病例的約85%，半數發生在中國。盡管過去十年ESCC研究取得了顯著進展，但診斷仍依賴于內鏡檢查，而程序性細胞死亡蛋白1（PD-1）抑制劑等新型療法的療效有限。這些限制凸顯了進一步研究以闡明ESCC潛在機制的迫切性。腫瘤微環境的復雜性，包括免疫細胞、基質細胞、細胞外基質和微生物，已成為理解ESCC發病機制的關鍵。近年來越來越多的證據強調微生物組與免疫微環境之間的新興相互作用，微生物組通過物理相互作用、代謝產物產生和致癌毒素生成等過程促進癌癥的發生和發展。然而，ESCC微生物組的研究仍相對不足，現有研究往往受限于小樣本隊列和對16S核糖體RNA（rRNA）測序的依賴，且機制研究主要集中在從其他癌癥移植的兩種病原體——Fusobacterium nucleatum和Porphyromonas gingivalis上。因此，系統探索與ESCC發病機制相關的更廣泛微生物景觀至關重要。

在這項研究中，研究人員利用多組學技術結合動物模型，深入探討了ESCC瘤內微生物組的組成、功能及其與宿主免疫微環境的相互作用。論文發表于《SCIENCE ADVANCES》期刊。

為開展研究，作者主要運用了以下關鍵技術方法：對來自119名ESCC患者的配對腫瘤-正常組織進行宏基因組測序，并對45個樣本進行單細胞RNA測序（scRNA-seq）以分析微生物-宿主互作；通過熒光原位雜交（FISH）和定量聚合酶鏈反應（qPCR）驗證關鍵微生物的富集；使用皮下腫瘤小鼠模型進行體內功能驗證；通過流式細胞術、蛋白質印跡（Western blot）和代謝組學分析揭示微生物代謝產物的作用機制。樣本隊列主要來源于中國河南省林州市食管癌醫院在2018年至2021年間接受手術切除的ESCC患者。

通過對119例ESCC患者的配對腫瘤和癌旁正常組織進行宏基因組測序，研究人員發現腫瘤組織與正常組織的微生物群落結構存在顯著差異，樣本類型（腫瘤 vs. 正常）是影響瘤內群落結構的最重要因素。腫瘤組織中細菌載量更高，且富集的物種多為厭氧或兼性厭氧菌。他們鑒定了87個在腫瘤組織中富集的物種和77個在正常組織中富集的物種。通過多變量Cox回歸分析，確定了116個與ESCC總生存期（OS）顯著相關的物種，其中101個被歸類為不良預后微生物，15個為有利預后微生物。特別聚焦于腫瘤富集且與不良預后相關的微生物（TPPMs），Parvimonas micra（P. micra）被確定為最主要的TPPM之一。其在腫瘤組織中的富集通過qPCR和FISH得到證實，并且在獨立的胃癌（GC）和結直腸癌（CRC）數據集分析中，P. micra在腫瘤組織中的豐度也顯著更高，提示其在胃腸道癌癥中的富集可能是一種普遍現象。此外，對泛癌免疫治療隊列數據的分析表明，對免疫檢查點抑制劑（ICIs）無反應的患者比有反應的患者表現出更高的P. micra豐度。

利用單細胞RNA測序數據，研究人員分析了ESCC腫瘤微環境的細胞組成和功能。他們發現ESCC腫瘤中富含CD4⁺調節性T細胞（T_reg）和肌成纖維樣癌癥相關成纖維細胞（myCAFs），而CD8⁺組織駐留記憶T細胞（CD8_Trm）和CD4⁺組織駐留記憶T細胞（CD4_Trm）則減少。生存分析顯示，腫瘤組織中CD4⁺T_reg細胞比例較高與較短的總生存期相關。進一步分析發現，P. micra的豐度與CD4⁺T_reg細胞和CD4⁺增殖性T細胞的浸潤呈正相關。多重免疫熒光（mIF）染色證實，與癌旁正常組織相比，腫瘤中T_reg細胞浸潤增加，并且P. micra水平與腫瘤和癌旁正常組織中的T_reg細胞浸潤均相關。

為了驗證P. micra的促癌作用，研究人員使用了皮下腫瘤小鼠模型。瘤內注射P. micra顯著促進了腫瘤生長，并通過FISH分析證實了其在腫瘤內的定植。mIF染色顯示，與磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）對照組相比，P. micra處理組腫瘤組織中的T_reg細胞浸潤顯著增加。同時，在P. micra處理組的腫瘤組織中，細胞毒性GZMB⁺CD8⁺T細胞的比例顯著下降，而耗竭性PD-1⁺CD8⁺T細胞的比例相應增加。這些發現表明，P. micra可能通過促進T_reg細胞浸潤到腫瘤微環境來促進ESCC進展，進而抑制抗腫瘤免疫反應。

為了探究P. micra是否通過其分泌物質影響T細胞功能，研究人員用P. micra條件培養基（P. micraCM）或熱滅活的P. micra處理人T淋巴細胞白血病細胞系Jurkat和小鼠脾臟CD4⁺T細胞。結果顯示，P. micraCM以劑量依賴性方式上調了FOXP3、TGFB1和IL10的mRNA水平以及FOXP3、TGF-β1和IL-10的蛋白水平，并增加了FOXP3⁺CD25⁺T_reg細胞的比例，而熱滅活的P. micra則沒有顯著影響。熱滅活的P. micraCM與未滅活的P. micraCM效果相似，表明P. micra產生的小分子代謝物而非分泌蛋白，對通過增強T_reg細胞活性相關關鍵調節因子和效應分子的表達來調節T細胞功能至關重要。體內實驗也證實，瘤內注射P. micraCM能顯著促進腫瘤生長，并增加T_reg細胞浸潤，同時降低CD8⁺T細胞的細胞毒功能并增加其耗竭標記物表達。體外細胞增殖實驗表明，P. micraCM并未顯著改變正常食管上皮細胞或ESCC細胞的增殖。這些發現共同表明，P. micra通過其代謝物誘導FOXP3⁺T_reg分化來促進腫瘤生長，而非直接刺激ESCC細胞增殖。

為了鑒定P. micra中介導腫瘤進展的微生物代謝物，研究人員對皮下腫瘤模型的腫瘤間質液進行了非靶向代謝組學分析。與PBS組相比，注射P. micra的腫瘤表現出不同的代謝組學特征，在細菌衍生的代謝物中，p-cresol（p-甲酚）的變化最為顯著。其初級衍生物p-cresol sulfate（PCS）是所有代謝物中差異最顯著的，另一個衍生物p-cresol glucuronide也表現出明顯差異。對P. micra參考基因組的同源性分析發現，其序列與酪氨酸轉化為p-cresol途徑中的關鍵酶（如FldBC復合物、HpdA和AcdA）具有顯著相似性，提示P. micra具有產生p-cresol的遺傳潛力。質譜分析證實，與對照培養基相比，P. micra培養物中p-cresol水平顯著升高。先前研究表明，p-cresol及其衍生物PCS可通過產生活性氧（ROS）在各種細胞類型中誘導氧化應激。而T_reg細胞依賴于氧化磷酸化衍生的ROS來穩定FOXP3表達并維持免疫抑制穩定性。因此，研究人員假設p-cresol和PCS誘導的ROS可能調節T_reg分化和功能。實驗證實，p-cresol處理以劑量依賴性方式上調FOXP3、IL-10和TGF-β1的蛋白水平，并增強ROS水平，而這種效應可被ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）抑制。此外，蛋白質印跡分析、qPCR和流式細胞術結果均表明，NAC能夠消除p-cresol驅動的T_reg分化和功能。單細胞RNA測序數據分析顯示，T_reg細胞具有最高的ROS特征評分，且CD4⁺T細胞的ROS特征評分與組織中P. micra的相對豐度呈正相關，支持了P. micra提升CD4⁺T細胞ROS水平的假設。體內實驗進一步證明，在皮下腫瘤小鼠模型中瘤內注射p-cresol可顯著促進腫瘤生長，增加T_reg細胞浸潤，同時降低CD8⁺T細胞的細胞毒性并增強其耗竭，而所有這些p-cresol誘導的效應均可通過施用NAC來消除。

本研究證明了食管腫瘤微生物組與癌旁正常組織存在顯著差異，并確定了P. micra是一種通過代謝物介導的免疫抑制促進ESCC進展的關鍵細菌。首先，研究發現腫瘤組織富含厭氧菌，這表明缺氧的腫瘤微環境可能選擇性地支持它們的生長。值得注意的是，在腫瘤中富集并與較差臨床結果相關的微生物（即TPPMs）主要由與牙周病、齲齒和牙髓感染相關的口腔微生物組成。這進一步得到臨床觀察的支持，即口腔衛生不良與ESCC風險增加相關。口腔微生物易位正日益被視為跨疾病的致病機制。本研究通過多方面的分析和實驗驗證，揭示了P. micra在ESCC腫瘤進展中的關鍵作用。P. micra是一種營養要求苛刻、革蘭氏陽性、專性厭氧菌，主要定植于口腔黏膜表面。其富集已在口腔鱗狀細胞癌、胃癌和結直腸癌中被記錄。然而，其在腫瘤進展中的機制作用在很大程度上仍未探索，僅在結直腸癌中有少量研究。與這些研究不同，本研究發現P. micra并未顯著影響正常食管上皮細胞或ESCC細胞的增殖。相反，我們證明P. micra通過促進免疫抑制顯著塑造了腫瘤微環境。具體來說，P. micra定植導致腫瘤微環境中T_reg細胞浸潤增加。這種差異突出了宿主-微生物組相互作用的組織特異性，并表明P. micra可能根據局部免疫和代謝環境采取不同的致癌機制。代謝物通過免疫調節在腫瘤發生中發揮著復雜而關鍵的作用。與這些已確立的機制相反，對ESCC的代謝組學分析未發現短鏈脂肪酸或色氨酸代謝物水平有顯著變化，而是發現了p-cresol及其衍生物的富集。本研究證明了其在T_reg分化和腫瘤進展中的作用。具體來說，p-cresol提高了CD4⁺T細胞中的ROS水平，促進FOXP3⁺T_reg分化，并創造一個免疫抑制微環境從而促進腫瘤生長。這項工作確定了p-cresol是一種關鍵的微生物代謝物，它將微生物群失調與腫瘤免疫耐受聯系起來，增進了我們對微生物衍生代謝物如何影響腫瘤微環境的理解。值得注意的是，對泛癌免疫治療隊列的分析表明，P. micra富集與免疫治療反應性降低之間存在潛在關聯。我們的研究結果表明，將免疫療法（如PD-1抑制劑）與抗氧化劑（如NAC）聯合使用，可能是治療P. micra富集型ESCC的一種有前景的策略。然而，仍有一些問題尚未解決。盡管我們聚焦于P. micra作為一個關鍵物種，但它并非腫瘤中富集或與不良預后相關的唯一微生物。其在更廣泛的黏膜多微生物群落中的協同相互作用對腫瘤發展的影響也尚未探索。在機制上，雖然我們確定了p-cresol分泌及其與T_reg細胞的相互作用是關鍵，但其他代謝物以及與不同免疫或基質細胞的相互作用也可能在ESCC進展中發揮作用。此外，我們的研究僅關注ESCC和正常組織，缺乏癌前病變樣本，這需要進一步研究來闡明微生物組在ESCC發展不同階段的作用。新興研究表明，瘤內微生物的分布并非隨機，而是表現出不同的空間偏好。因此，迫切需要通過空間組學數據來繪制這些群落的結構圖并解讀它們與腫瘤微環境之間錯綜復雜的相互作用。總之，本研究揭示了P. micra通過微生物代謝物介導的免疫調節這一關鍵機制驅動ESCC進展。這凸顯了腫瘤相關微生物，特別是口腔致病菌，通過多種機制在腫瘤發生中的關鍵作用，值得進一步研究。此外，應探索它們在腫瘤風險評估和治療干預中的轉化潛力。