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本文利用高分辨率冷凍電鏡，首次解析了經典/凝集素通路C4b2a-C3和替代通路C3bBbP-C3兩種關鍵補體C3轉化酶與其底物C3結合的Michaelis復合物結構。研究闡明了不同通路C3轉化酶精確識別C3的分子基礎，揭示了C4b2a組裝激活的動態過程，并闡明了備解素（Properdin）穩定替代通路C3轉化酶的具體機制，為理解補體激活的核心步驟提供了決定性結構見解，并為靶向C3轉化酶的療法設計奠定了理論基礎。
補體系統是人體先天免疫防御的核心組成部分，它像一支高度協調的“快速反應部隊”，負責識別和清除入侵的病原體、調節免疫反應并維持機體穩定。然而，一旦這支“部隊”失控，過度激活或功能失調，就會“誤傷”自身組織，導致包括腎臟疾病、風濕性疾病、神經系統疾病和心血管疾病在內的多種嚴重人類疾病。近年來，研究還發現補體系統失調與重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）感染后血栓形成等病理過程密切相關。因此，精確調控補體系統的激活，是治療相關疾病的關鍵。
補體系統的激活主要通過三條“路徑”啟動：經典途徑、凝集素途徑和替代途徑。無論哪條路徑，其“兵工廠”最終都匯聚于一個核心“彈藥”——補體第三組分（C3）。C3需要被專門的“切割酶”——C3轉化酶——精準切割，才能釋放出具有活性的片段C3a和C3b，從而啟動后續一連串的免疫級聯反應。其中，經典和凝集素途徑使用C4b2a復合物作為C3轉化酶，而替代途徑則使用C3bBb復合物。這兩種轉化酶就像兩把關鍵的“分子剪刀”，決定了整個補體反應能否有效進行。
然而，這兩把“剪刀”本身非常不穩定，形成后幾分鐘內就會解體，這給研究它們如何精確“抓住”并“剪開”C3底物帶來了巨大挑戰。盡管過去的研究通過解析C3bB酶原復合物以及C3bBb與抑制劑SCIN的復合物結構，對替代途徑轉化酶的組裝有了初步認識，但C3轉化酶識別底物的精確分子機制，以及經典/凝集素途徑C4b2a轉化酶的組裝與激活過程，仍然籠罩在迷霧之中。為了撥開這層迷霧，一個研究團隊通過尖端技術，捕捉到了這些“分子剪刀”在工作狀態下的高清三維圖像。
研究人員利用高分辨率冷凍電子顯微鏡（cryo-EM），成功解析了處于功能狀態的三種關鍵復合物的原子級結構：這包括了：1）經典/凝集素途徑C4b2a轉化酶與底物C3結合的“Michaelis復合物”（反應中間態）結構（分辨率3.1埃）；2）C4b2酶原（即C4b與未切割的C2形成的復合物）的“裝載”狀態（2.9埃）和“激活”狀態（3.1埃）結構；以及3）在備解素（Properdin, P）存在下的替代途徑C3bBb轉化酶與底物C3結合的Michaelis復合物結構（2.6埃）。這些高清“快照”系統揭示了補體激活核心步驟的精細藍圖，相關成果發表在《SCIENCE ADVANCES》上。
主要技術方法
本研究主要采用以下技術：1）蛋白質純化：從人血漿中純化天然C3和C4，并通過蛋白酶處理制備C3b和C4b；利用人胚腎（HEK）293F細胞表達系統制備重組C2、因子B（FB）、因子D（FD）及其催化失活突變體（S679A和S699A），以及插入了煙草蝕紋病毒（TEV）蛋白酶切割位點的單體化備解素。2）復合物組裝與冷凍電鏡樣品制備：將純化的蛋白質按特定摩爾比混合，并在金屬離子（Ni2+）存在下，經蛋白酶（C1s或FD）短暫處理以形成轉化酶-底物復合物，隨后快速冷凍制備樣品。3）高分辨率冷凍電鏡數據采集與處理：使用300-kV Titan Krios G4顯微鏡采集數據，并利用CryoSPARC軟件進行數據處理、三維重構和局部分析。4）原子模型搭建與精修：基于冷凍電鏡密度圖，使用AlphaFold2預測和已有結構作為初始模型，通過Coot和PHENIX軟件進行手動搭建、修正和精修，最終獲得高精度的原子結構模型。
研究結果
Cryo-EM structure of the C4b2a-C3 complex（C4b2a-C3復合物的冷凍電鏡結構）
研究人員成功捕獲了C4b2a與C3結合的Michaelis復合物。在該結構中，C4b呈現出與C3b相似的典型“傀儡師”活性構象。底物C3則保持非活性構象，其硫酯結構域（TED）被安全地折疊在CUB和MG8結構域下方。C2a通過其von Willebrand A（vWA）結構域結合在C4b的C345C結構域上，而其絲氨酸蛋白酶（SP）結構域則轉向C3，為底物切割做好準備。
Substrate recognition mechanism of C4b2a（C4b2a的底物識別機制）
結構分析揭示了C4b2a特異性識別C3的精細機制。C4b和C2a共同參與了對C3的識別，確保了底物特異性。C4b與C3之間的界面涉及多個巨球蛋白（MG）結構域，形成了約24個氫鍵和鹽橋相互作用。C2a則通過其SP結構域捕獲了C3的“剪切環”（包含Arg748-Ser749切割位點），將其精準地定位在由Asp561-His507-Ser679（Ala）組成的催化三聯體中心。特別值得注意的是，C3的結合誘導了C2a-SP中Lys676構象變化，從而形成了一個功能性的氧陰離子空穴，為催化反應做好了準備。
Formation of the classical and lectin pathway C3 convertase（經典和凝集素途徑C3轉化酶的形成）
通過解析C4b2酶原的“裝載”和“激活”狀態結構，并結合C4b2a-C3復合物結構，研究人員可視化了C3轉化酶形成的動態過程。在裝載狀態，C2（對應FB）的CCP1-CCP3和vWA結構域與C4b結合。在激活狀態，C2的SP結構域構象變得穩定并錨定在C4b上。當C2被C1s或MASP2切割、釋放C2b片段后，形成的C2a（vWA-SP）會發生巨大的構象重排：vWA結構域發生位移，而SP結構域則圍繞vWA-SP連接區擺動約118度，使其能夠有效地對接C3底物。這種大幅度的構象變化解釋了C4b2a轉化酶的內在不穩定性。
Cryo-EM structure of the C3bBbP-C3 complex（C3bBbP-C3復合物的冷凍電鏡結構）
研究人員同樣解析了替代途徑C3bBb轉化酶在備解素存在下與C3結合的Michaelis復合物結構。在該結構中，C3b與C3形成了一個類二聚體界面，但相互作用面積略小于C4b-C3界面。Bb與C3的相互作用展現出獨特特征：Bb-SP結構域中一個更長的β-發夾結構（β-hairpin）能誘導C3的α′-NT區域形成一段短鏈，從而更好地結合底物。此外，Bb的Asp723能更有效地結合C3的Arg748（P1殘基）。
Stabilization of C3bBb by properdin（備解素對C3bBb的穩定作用）
結構清晰地展示了備解素如何穩定C3bBb轉化酶。備解素主要通過與C3b的C345C結構域結合來發揮作用。更重要的是，其TSR5-stirrup和TSR6-stirrup兩個關鍵環插入到C3b與Bb的界面之間，像一個“分子膠水”一樣增強了兩者之間的相互作用。例如，備解素的Arg329既與C3b的Phe1659堆疊，又與Bb主鏈的Leu349形成氫鍵。此外，與C3bBP酶原復合物相比，在成熟的C3bBbP結構中，備解素的Arg330發生了顯著旋轉，幫助錨定C3b的末端殘基，從而維持C3b與Bb-vWA中金屬離子依賴的粘附位點（MIDAS）的結合，進一步穩定了轉化酶。
研究結論與意義
這項研究通過解析C4b2a-C3和C3bBbP-C3兩種Michaelis復合物的高分辨率冷凍電鏡結構，首次在原子層面上全面揭示了經典/凝集素途徑和替代途徑C3轉化酶識別其共同底物C3的精確分子機制。研究發現，盡管兩條通路的轉化酶（C4b2a和C3bBb）在整體結構上相似，但在底物結合細節上存在顯著差異：C4b與C3的相互作用界面更優化，而Bb則通過更長的β-發夾和更好的帶電荷殘基互補來增強與C3的結合。研究還動態展示了C4b2a從酶原裝載、激活到最終結合底物的構象變化過程，并闡明了備解素通過其特定的環狀結構插入C3b-Bb界面，充當“分子穩定器”的具體機制。
這些發現具有深遠的意義。首先，研究為理解補體激活的核心步驟提供了決定性的結構框架，解決了該領域長期懸而未決的關鍵問題。其次，通過序列比對，研究指出相較于小鼠，大鼠的C4與人類更為相似，這可能為選擇更合適的臨床前動物模型提供了依據。再者，研究為針對C3轉化酶開發治療補體相關疾病的新藥指明了方向。例如，通過將已獲批藥物pegcetacopan（一種compstatin家族環肽）和iptacopan（一種FB抑制劑）的結合位點與本研究解析的結構進行比對，清晰地展示了它們如何通過空間位阻或直接占據底物結合位點來抑制轉化酶功能。這為優化現有藥物和理性設計靶向C2（針對經典/凝集素途徑）的新型小分子抑制劑提供了藍圖。最后，該研究建立的模型也有助于未來探索C5轉化酶的組裝機制以及備解素寡聚體在補體終端通路激活中可能扮演的局部聚集作用�？偠灾@項工作從根本上增進了我們對補體系統這一關鍵免疫“開關”的理解，并將推動針對多種補體介導疾病的精準療法的開發。
