《SCIENCE ADVANCES》：KRASG12V/HLA-A*02:01–targeted chimeric antigen receptor T cells exhibit potent preclinical activity against solid tumors
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本研究針對實體瘤靶向治療缺乏高特異性靶點的難題，研發(fā)了靶向KRASG12V新抗原/HLA-A*02:01復合體的CAR-T細胞。研究證實，所構(gòu)建的B9 CAR-T細胞在體外及多種體內(nèi)模型中均能特異性殺傷腫瘤，并展現(xiàn)出良好的安全性，為攜帶該突變的廣泛患者群體提供了一種極具前景的精準免疫治療新策略。
在癌癥治療的戰(zhàn)場上，針對血液腫瘤的CAR-T（嵌合抗原受體T）細胞療法已取得了革命性的成功，然而，面對更常見的實體瘤，科學家們卻屢屢受挫。其中一個核心瓶頸在于難以找到“理想靶點”——這些靶點必須只在腫瘤細胞上大量表達，而在正常組織中幾乎絕跡，從而確保治療既能精準“殲敵”，又不會“誤傷友軍”。傳統(tǒng)的腫瘤相關(guān)抗原往往難以滿足這一苛刻要求，導致療效不佳或引發(fā)嚴重的脫靶毒性。
那么，是否存在一種近乎完美的靶點呢？答案是腫瘤特異性新抗原，它們源于腫瘤細胞獨有的基因突變，是真正的腫瘤“身份證”。在眾多癌基因突變中，KRAS基因突變極為常見，堪稱“癌中之王”的胰腺癌中超過90%的患者攜帶此突變。其中，KRAS第12號密碼子的纈氨酸突變（G12V）在胰腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌中高頻率出現(xiàn)，卻因結(jié)構(gòu)“光滑”而一直缺乏有效的靶向藥物，成為臨床上亟待攻克的堡壘。此外，針對此類細胞內(nèi)新抗原的T細胞療法還受限于人類白細胞抗原（HLA）的多樣性，既往研究多聚焦于在亞洲人群常見的HLA-A*11:01等亞型，限制了其在全球更廣泛患者中的應用。
因此，開發(fā)一種能夠靶向KRASG12V這一高發(fā)突變，且能與在歐美人群中高頻分布（約30-50%）的HLA-A02:01分子相結(jié)合的新型免疫療法，具有巨大的臨床價值和市場潛力。近期發(fā)表在頂級期刊《SCIENCE ADVANCES》上的一項研究，成功將這一設想變?yōu)楝F(xiàn)實。中國研究人員通過噬菌體抗體展示技術(shù)篩選出高親和力抗體，構(gòu)建了靶向KRASG12V/HLA-A02:01復合體的新型CAR-T細胞，并在臨床前研究中展現(xiàn)出卓越的抗腫瘤活性和安全性。
為了開展此項研究，研究人員運用了幾個關(guān)鍵的技術(shù)方法：首先，利用噬菌體抗體展示技術(shù)從健康人源單鏈可變區(qū)片段（scFv）文庫中篩選并鑒定出能特異性結(jié)合KRASG12V/HLA-A02:01復合體的高親和力抗體（B9與A4）。其次，構(gòu)建了表達不同靶點組合的工程化細胞系（如K562）以及來源于患者的結(jié)直腸癌類器官（PDO）模型，用于體外功能驗證。再者，通過單細胞RNA測序（scRNA-seq）深入解析了CAR-T細胞激活后的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性。最后，在免疫缺陷小鼠（NCG）中建立了皮下、轉(zhuǎn)移性及腹膜播散性胰腺導管腺癌（PDAC）等多種體內(nèi)模型，并利用表達人HLA-A02:01的轉(zhuǎn)基因小鼠（NCG-HLA-A2.1）和免疫健全的C57BL/6小鼠模型，全面評估了CAR-T細胞的療效與安全性。
研究結(jié)果
篩選針對KRASG12V/HLA-A02:01復合體的特異性scFv并構(gòu)建CAR-T細胞結(jié)構(gòu)*
研究人員通過生物信息學分析確認了KRASG12V突變在多種實體瘤中的高發(fā)性，并選擇了人群分布廣泛的HLA-A02:01等位基因。通過多輪噬菌體展示篩選與驗證，從近千個克隆中鑒定出兩個（A4和B9）能特異性結(jié)合KRASG12V/HLA-A02:01復合體、而不結(jié)合野生型復合體的單克隆抗體。其中B9抗體表現(xiàn)出更高的親和力（EC50= 2.589 nM）。利用這些scFv，研究團隊成功構(gòu)建了A4.CAR和B9.CAR兩種CAR-T細胞，并驗證了其高轉(zhuǎn)導效率和以效應記憶T細胞為主的表現(xiàn)。
B9 CAR-T細胞誘導殺傷KRASG12V/HLA-A02:01陽性腫瘤*
體外功能實驗表明，B9 CAR-T細胞能特異性識別并高效殺傷經(jīng)KRASG12V肽段脈沖或內(nèi)源性表達KRASG12V/HLA-A*02:01的腫瘤細胞系（如CFPAC-1、SW620），同時釋放高水平的干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）。這種殺傷作用嚴格依賴靶點的存在，當敲除腫瘤細胞的KRAS基因或抗原提呈關(guān)鍵蛋白β2微球蛋白（B2M）后，殺傷作用消失。B9 CAR-T細胞對另一種常見突變KRASG12C無反應，顯示出高度的特異性。
B9 CAR-T細胞對患者來源的CRC類器官展現(xiàn)出強效細胞毒作用
為了在更接近臨床的模型中驗證療效，研究團隊建立了來自KRASG12V陽性結(jié)直腸癌（CRC）患者的腫瘤類器官（PDO）。結(jié)果顯示，B9 CAR-T細胞能有效誘導靶向類器官發(fā)生caspase-3依賴的凋亡，并分泌大量IFN-γ和TNF-α，而對KRASG12V陰性的對照類器官無此作用，證明了其在模擬人體腫瘤微環(huán)境中的有效性和特異性。
單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜揭示B9 CAR-T細胞在抗原特異性激活過程中的代謝和功能異質(zhì)性
通過單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析，研究人員發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)導（UTD）的T細胞相比，B9 CAR-T細胞在抗原刺激后，增殖性T細胞和記憶T細胞亞群顯著擴增。深入分析表明，這些擴增的細胞亞群高表達細胞因子（如IFN-γ）并富集于PI3K-Akt、MAPK等關(guān)鍵的T細胞激活通路，同時其能量代謝活動（如氧化磷酸化、糖酵解）顯著增強，為其強大的效應功能提供了代謝基礎。
B9 CAR-T細胞抑制皮下PDAC異種移植瘤的生長
在免疫缺陷小鼠皮下胰腺癌模型中，單次輸注B9 CAR-T細胞能有效控制腫瘤生長，顯著延長小鼠生存期，所有治療組小鼠存活超過80天，而對照組在60天內(nèi)全部死亡。
B9 CAR-T細胞在人轉(zhuǎn)移性PDAC模型中顯示治療效果
在經(jīng)靜脈注射建立的血行轉(zhuǎn)移模型中，B9 CAR-T細胞能劑量依賴性地抑制CFPAC-1腫瘤細胞的擴散和生長。相反，對于僅表達HLA-A*02:01而不表達KRASG12V的Caco-2腫瘤細胞，B9 CAR-T細胞則無治療作用，再次印證了其殺傷的嚴格特異性。
B9 CAR-T細胞清除PDAC模型中的腹膜轉(zhuǎn)移灶
在模擬臨床腹膜轉(zhuǎn)移的模型中，腹腔輸注B9 CAR-T細胞能完全清除腹腔內(nèi)腫瘤，并為小鼠帶來顯著的生存獲益。
B9 CAR-T細胞的全面脫靶分析揭示關(guān)鍵識別基序以及與人類蛋白質(zhì)組的極小交叉反應性
為確保安全性，研究人員進行了細致的脫靶評估。通過氨基酸掃描（X-scan）突變分析，確定了B9 CAR-T細胞識別KRASG12V肽段的關(guān)鍵氨基酸位點。基于此識別基序，在整個人類蛋白質(zhì)組中進行生物信息學搜索和親和力預測，僅發(fā)現(xiàn)兩個（RNF112和SUOX來源的）潛在交叉反應肽段，且在功能驗證中其激活CAR-T細胞的能力遠弱于目標肽段。
B9 CAR-T細胞未顯示潛在的體內(nèi)毒性
在表達人HLA-A*02:01的轉(zhuǎn)基因NCG小鼠（NCG-HLA-A2.1）中進行安全性評估。輸注B9 CAR-T細胞一個月內(nèi)，小鼠體重穩(wěn)定，血常規(guī)指標無顯著異常，主要器官（心、肝、脾、肺、腎）的組織病理學檢查未發(fā)現(xiàn)T細胞異常浸潤或損傷，初步證明了其良好的體內(nèi)安全性。
在完全免疫健全的小鼠模型中評估B9 CAR-T細胞的安全性和有效性
為進一步驗證在具有完整免疫系統(tǒng)的環(huán)境中的安全性，研究團隊構(gòu)建了免疫健全的C57BL/6小鼠模型。輸注經(jīng)過鼠源化改造的B9 CAR-T細胞后，不僅有效抑制了腫瘤生長，延長了生存期，且未引起明顯的體重下降、細胞因子釋放綜合征或器官損傷，在免疫健全背景下再次驗證了其治療潛力和安全性。
結(jié)論與討論
本研究的核心結(jié)論是成功開發(fā)了一種靶向KRASG12V/HLA-A02:01新抗原復合體的CAR-T細胞療法。與目前主要針對KRASG12C和G12D的小分子抑制劑，或受限于HLA-A11:01等特定亞型的T細胞受體療法相比，該研究具有多重重要意義。首先，它攻克了KRASG12V這一長期缺乏靶向治療選項的高發(fā)突變難題。其次，所選用的HLA-A*02:01等位基因在全球尤其是歐美人群中有更高的分布頻率，使得該療法有望惠及更廣泛的患者群體。再者，研究采用的噬菌體抗體展示平臺具有高通量、高效率篩選的優(yōu)勢，為未來針對其他新抗原或HLA亞型開發(fā)多靶點聯(lián)合療法奠定了技術(shù)基礎。
在安全性方面，通過多層次、多模型的嚴謹評估，證實了B9 CAR-T細胞具有高度的靶點特異性和可接受的脫靶風險譜。盡管臨床前模型存在局限性，但現(xiàn)有數(shù)據(jù)為其向臨床轉(zhuǎn)化提供了強有力的支持。總之，這項研究不僅為KRASG12V突變的實體瘤患者帶來了新的治療希望，也展示了將新抗原靶向策略與優(yōu)勢HLA等位基因相結(jié)合以開發(fā)“通用型”精準免疫療法的巨大潛力，為未來針對實體瘤的CAR-T細胞治療開辟了新道路。
