《ACS Applied Bio Materials》：3D-Printed Bone Spacers with Dual-Phase Structure: A Comparison of Biogenic and Commercial Hydroxyapatite for Potential Treatment of Bone Defects
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本研究成功利用擠出式3D打印技術制備出具有致密外殼和多孔內核雙相結構的骨墊片，并對比評估了魚源性羥基磷灰石（Bio-HAp）與商業羥基磷灰石（Co-HAp）的理化特性、微觀結構、力學性能及體外細胞相容性。結果表明，Bio-HAp骨墊片具有更高的總孔隙率（約51%），而兩者壓縮強度和模量與人體骨骼相當，且細胞存活率均超過96%，展現出良好的生物相容性。這項工作為骨缺損修復提供了一種具有仿生結構、可定制的生物陶瓷墊片新策略。
引言
由創傷、感染或手術引起的骨缺損是骨科治療中的重大挑戰。目前，骨缺損的管理通常需要使用骨移植物或合成墊片來提供臨時結構支撐并促進骨再生。自體骨移植被認為是“金標準”，但存在供區并發癥、供應有限等限制。異體骨移植則存在免疫排斥和疾病傳播的風險。因此，可生物降解且具有生物活性的材料作為骨墊片受到了廣泛關注。其中，鈣磷（CaPs）材料因其生物相容性、與天然骨礦物的相似性以及骨傳導特性而備受青睞。羥基磷灰石（HAp，化學式Ca10(PO4)6(OH)2）是CaPs家族中的重要成員，具有與天然骨相似的結晶度以及生物活性和可吸收特性，在骨科應用中潛力巨大。
近年來，魚鱗作為HAp的來源展現出巨大前景。魚鱗是漁業豐富的副產品，為HAp的可持續、低成本制備提供了可能，其衍生材料具有獨特的特性，可能更適合生物醫學應用。然而，大多數已報道的HAp骨替代物仍基于完全致密或均勻多孔的結構，這種簡化的設計往往需要在機械穩定性和生物功能之間進行權衡。受天然骨分層結構（致密的皮質骨外層提供強度，多孔的松質骨內核允許營養物質和細胞通過）的啟發，本研究采用擠出式3D打印技術，設計并制造了一種具有致密外殼和多孔內核的雙相結構骨墊片，旨在模擬天然骨結構，同時提供足夠的機械穩定性和支持細胞附著、增殖及后續組織形成的支架特性。
材料與方法
材料：本研究使用的生物源性羥基磷灰石（Bio-HAp）來源于泰國春武里府采集的海鱸魚魚鱗。商業羥基磷灰石（Co-HAp，粒徑5 μm）購自Sigma-Aldrich。使用羥丙基甲基纖維素（HPMC）作為HAp膏體制備的粘結劑。
Bio-HAp粉末制備：采用堿熱處理方法從海鱸魚鱗中提取Bio-HAp。簡要步驟包括：首先用0.1 M鹽酸在室溫下攪拌1小時進行脫蛋白處理，然后用5% (w/v) 氫氧化鈉溶液在60°C下攪拌處理7小時進行堿熱處理，隨后用去離子水中和，并通過熱風烘箱干燥、研磨和過篩（<45 μm）得到Bio-HAp粉末。
骨墊片制備：使用3D生物打印機（Dr. INVIVO 4D2）制造骨墊片生坯。將Bio-HAp粉末與1% w/v HPMC（溶于30%乙醇）以50%固含量混合制備打印膏體。雙相結構模型（圓柱形，15 × 10 mm）通過軟件設計，具有3 mm厚的致密外殼和30%填充密度的多孔內核。打印參數包括：噴嘴直徑0.6 mm，層高0.3 mm，打印速度2 mm/s等。打印完成后，生坯在40°C烘箱中干燥過夜，隨后在馬弗爐中按特定升溫程序進行燒結。Co-HAp骨墊片采用相同步驟制備以供對比。
表征與分析：
- 1.
Bio-HAp粉末表征：使用場發射透射電子顯微鏡（FE-TEM）觀察形貌，并通過配備的能譜儀（EDS）分析元素組成和Ca/P原子比。
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骨墊片表征：
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收縮率、密度與孔隙率：使用游標卡尺測量燒結前后尺寸，通過阿基米德原理測定密度和孔隙率。
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晶體結構與物相：使用X射線衍射儀（XRD）分析燒結后樣品的晶體結構和物相。
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形貌與微觀結構：使用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察生坯及燒結后（壓縮測試斷裂后）樣品的形貌和微觀結構。
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力學性能：使用萬能試驗機（UTM）進行壓縮測試，直至樣品失效，以測定最大應力、壓縮屈服強度與應變以及壓縮模量。
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體外細胞活力與毒性評估：使用人軟骨粗細胞（HCPCs）進行活/死細胞染色實驗，培養1、3、7天后，通過共聚焦顯微鏡觀察并計算細胞存活率，評估材料的細胞相容性。
結果與討論
Bio-HAp粉末的特性：FE-TEM圖像顯示，Bio-HAp顆粒主要為納米級的棒狀結構，同時也存在不規則形狀和團聚現象。EDS分析表明其Ca/P原子比為1.67，符合化學計量HAp的特征，并檢測到微量的鎂（Mg）元素，這來源于生物源HAp，對增強生物活性和促進骨形成有積極作用。
骨墊片的特性：
- 1.
收縮率、密度與孔隙率：燒結后，Bio-HAp骨墊片的線性和體積收縮率分別為21.00 ± 0.35% 和 52.09 ± 0.54%，低于Co-HAp骨墊片（26.38 ± 0.86% 和 61.07 ± 1.18%）。Bio-HAp骨墊片的總孔隙率（51.13 ± 2.94%）高于Co-HAp骨墊片（44.38 ± 1.01%），更高的孔隙率有利于促進成骨細胞生長和礦化基質形成。
- 2.
晶體結構與物相：XRD圖譜顯示，兩種骨墊片在燒結后均保留了純的HAp相，沒有發生相變，且顯示出高結晶度。主要衍射峰與標準HAp圖譜一致。
- 3.
形貌與微觀結構：SEM圖像揭示了兩種材料在生坯和燒結狀態的形貌差異。Co-HAp生坯由球形顆粒組成，結構相對均勻；而Bio-HAp生坯由不規則形狀顆粒組成，堆積結構較松散。燒結后，兩者均發生致密化，但Co-HAp顆粒融合更充分，形成更致密的微觀結構；Bio-HAp則因顆粒形狀不規則，存在更多的殘留孔隙和未完全形成的頸狀連接。斷裂表面分析顯示兩者均為沿晶界擴展的脆性斷裂。
- 4.
力學性能：應力-應變曲線顯示兩種墊片均表現出脆性材料特性。Bio-HAp骨墊片主要表現為單步失效，而Co-HAp骨墊片則表現出兩階段變形行為，這可能與打印結構的各向異性和內部缺陷有關。Bio-HAp骨墊片的極限抗壓強度和壓縮模量分別為14.69 ± 3.79 MPa和1028.76 ± 426.19 MPa，Co-HAp骨墊片則為15.91 ± 0.91 MPa和901.95 ± 89.28 MPa。兩者數值無顯著差異，且均落在人體骨骼的力學性能范圍內（抗壓強度約0.1-200 MPa，壓縮模量120-17,000 MPa）。
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體外細胞活力與毒性：活/死細胞染色實驗表明，在1、3、7天的培養期內，Bio-HAp和Co-HAp骨墊片上的細胞存活率均超過96%，與對照組無顯著差異。這證實了兩種材料均具有良好的體外細胞相容性，魚源性HAp的生物相容性可與商業HAp相媲美。
結論
本研究成功利用3D打印技術制備了具有雙相結構（致密外殼和多孔內核）的骨墊片，并系統比較了魚鱗源性HAp與商業HAp的性能。結果表明，魚源性HAp骨墊片具有更高的孔隙率，而兩種材料在壓縮強度、模量以及體外細胞相容性方面均表現相當，且力學性能與人體骨骼匹配。雙相結構設計模仿了天然骨的層次結構，致密外殼提供了機械穩定性和結構完整性，多孔內核則有利于物質傳輸和細胞活動。綜上所述，魚鱗衍生的Bio-HAp作為一種可持續的天然來源材料，是商業HAp的可行替代品，所開發的雙相HAp骨墊片在骨缺損修復應用中展現出良好的潛力。這項研究為基于生物源材料的定制化骨修復器械開發提供了新的見解和策略。
