《Journal of Advanced Research》：The module of PeGLK1-1–PeWRKY111–
PePMHA9 orchestrates stomatal aperture to enhance photosynthetic capacity in bamboo
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為揭示毛竹（Phyllostachys edulis）高效光合固碳的分子調控機制，本研究聚焦于控制光合作用的關鍵環節——氣孔開度。研究人員鑒定出一個原膜H+-ATP酶基因PePMHA9，并發現其表達受轉錄因子PeWRKY111直接激活，而PeWRKY111又能與另一轉錄因子PeGLK1-1互作，形成PeGLK1-1–PeWRKY111–PePMHA9調控模塊。該模塊受光信號誘導，共同作用于氣孔保衛細胞，通過調控PePMHA9的轉錄水平來影響氣孔開度，從而顯著提升毛竹和轉基因水稻的光合速率與生物量。此項研究不僅首次在竹子中揭示了氣孔調控光合作用的轉錄級聯網絡，為理解其卓越固碳能力提供了新見解，也為培育高光合效率的竹子新品種提供了關鍵靶點基因。
在應對全球變暖的挑戰中，森林的固碳能力是自然解決方案的關鍵一環。毛竹，作為一種生長速度驚人的禾本科植物，其碳匯能力甚至超過了許多熱帶雨林和針葉林，成為緩解溫室效應的“明星物種”。毛竹驚人的生長速度，本質上依賴于其高效的光合作用來制造有機物質。而在光合作用這個復雜的過程中，葉片上的微小氣孔扮演著至關重要的“大門”角色——它們控制著二氧化碳（CO2）進入葉片內部的通道。氣孔開得越大，CO2供應越充足，光合作用的“原料”也就越豐富。然而，長期以來，科學家們對竹子中究竟哪些基因在操控這扇“大門”，以及它們如何響應環境信號（如光照）來協同工作，仍知之甚少。理解這個調控網絡，對于挖掘竹子固碳潛力和指導高光效育種具有重大意義。
為了解開這個謎題，國際竹藤中心的研究團隊在《Journal of Advanced Research》上發表了一項研究。他們以毛竹為模型，系統探究了控制其氣孔開度、進而影響光合能力的關鍵基因及其調控機制。研究團隊主要運用了整合生理學、轉錄組學和分子生物學的研究策略。關鍵技術方法包括：利用LI-6800光合儀和掃描電鏡分析毛竹不同葉位葉片的生理指標與氣孔形態；通過加權基因共表達網絡分析（WGCNA）從轉錄組數據中篩選關鍵基因；在毛竹葉片和水稻中進行基因瞬時編輯、過表達和穩定轉化以驗證基因功能；并通過酵母單雜、雙熒光素酶報告、酵母雙雜、雙分子熒光互補和免疫共沉淀等一系列分子互作實驗，解析了轉錄因子對下游靶基因的調控關系。
研究結果
1. 毛竹不同葉位葉片的光合生理特征
研究人員首先測量了毛竹同一枝條上從頂端（L1）到底部（L5）五個不同位置葉片的光合指標。他們發現，位于L2至L4位置的功能葉具有更高的凈光合速率（Pn）和氣孔導度（Gs），同時其氣孔開度比例也更高。這表明這些葉位是毛竹進行CO2同化和能量供應的主要部位，為后續尋找關鍵調控基因提供了生理學依據。
2. 毛竹五個葉位的轉錄組分析
為了從分子層面探究毛竹葉片光合作用的遺傳基礎，研究者對上述五個葉位的葉片進行了RNA測序。通過加權基因共表達網絡分析，他們發現一個粉色模塊與凈光合速率、氣孔導度等光合指標高度相關。在該模塊中，他們鑒定出一個編碼原膜H+-ATP酶（Plasma Membrane H+-ATPase， PM H+-ATPase）的基因Pe_21959（后命名為PePMHA9）。該基因在光合組織（葉片）中特異性高表達，且其表達模式與凈光合速率的變化趨勢高度一致，提示它可能是調控竹子光合作用的關鍵樞紐基因。
3. PePMHA9通過調節氣孔開度參與植物光合作用
亞細胞定位實驗證實PePMHA9蛋白定位于細胞膜上。RNA原位雜交進一步顯示，PePMHA9的轉錄本在毛竹葉片的氣孔保衛細胞中富集，為其調控氣孔開度提供了空間證據。該基因的表達受光照誘導，在光下表達升高，在黑暗或弱光下表達降低。通過在毛竹葉片中瞬時敲低或過表達PePMHA9，研究者發現，敲低該基因會降低光系統II（PSII）的最大光化學效率（Fv/Fm）和電子傳遞速率（ETR II），同時增加非光化學淬滅（NPQ）；而過表達則能提高ETR II，降低NPQ。這表明PePMHA9在毛竹葉片的光合作用中起著關鍵作用。
為了進一步驗證其功能，研究團隊在水稻中過表達了PePMHA9。在高光條件下，轉基因水稻植株表現出更大的氣孔開度、更高的凈光合速率和氣孔導度，生物量（鮮重和干重）也顯著增加。相反，在弱光條件下，這些促進作用不明顯。這些結果證明，過表達PePMHA9可以通過促進氣孔開放來增強植物的光合能力，從而支持其生長。
4. PeWRKY111通過結合其啟動子促進PePMHA9轉錄
為了闡明PePMHA9的轉錄調控機制，研究人員從其共表達網絡中篩選出與之緊密相關的轉錄因子PeWRKY111。在PePMHA9的啟動子區域發現了三個潛在的WRKY結合位點（W-box）。通過酵母單雜、雙熒光素酶報告和GUS活性實驗，證實PeWRKY111能夠直接結合到PePMHA9的啟動子上并激活其轉錄。進一步的實驗將結合位點精確定位到一個特定的W-box基序（5′-GTCAA-3′）上，電泳遷移率變動分析也證實了PeWRKY111蛋白與該DNA序列的直接結合。
5. PeWRKY111與PeGLK1-1互作并協同激活PePMHA9
為了尋找與PeWRKY111協同工作的因子，研究者以PeWRKY111為誘餌進行了酵母雙雜交篩選，發現了一個光合作用相關的GOLDEN 2-LIKE（GLK）家族轉錄因子PeGLK1-1。通過酵母雙雜交、雙分子熒光互補、GST Pull-down和免疫共沉淀實驗，證實PeWRKY111與PeGLK1-1在細胞核內存在直接互作。更重要的是，雙熒光素酶報告實驗顯示，PeWRKY111和PeGLK1-1共同存在時，對PePMHA9啟動子的激活作用顯著強于PeWRKY111單獨存在時，表明兩者形成復合體后能協同增強PePMHA9的轉錄。
6. PeWRKY111和PeGLK1-1過表達增強轉基因水稻的光合能力
與PePMHA9類似，PeWRKY111和PeGLK1-1也在毛竹葉片中特異性表達，且受光誘導。在水稻中過表達這兩個基因，同樣能提升植株在高光下的凈光合速率、氣孔導度和氣孔開度，從而增加生物量。其中，PeGLK1-1的過表達在弱光下也表現出一定的促進作用。這進一步印證了PeWRKY111和PeGLK1-1在調控光合作用中的正向功能。
7. PeGLK1-1、PeWRKY111和PePMHA9共同參與毛竹光合作用
最后，研究者在毛竹葉片中瞬時敲低或過表達了PeWRKY111和PeGLK1-1。敲低任一個基因，都會導致PePMHA9表達下降、ETR II降低和NPQ升高；而過表達它們則能上調PePMHA9表達、提高ETR II并降低NPQ。這些體內實驗直接證明了PeGLK1-1、PeWRKY111和PePMHA9在毛竹光合作用中的功能是協同且可操作的。
研究結論與意義
本研究系統闡明了毛竹中一個新穎的光信號介導的轉錄調控模塊：PeGLK1-1–PeWRKY111–PePMHA9。該模塊的核心機制是：光信號誘導轉錄因子PeGLK1-1和PeWRKY111的表達，兩者在細胞核內相互作用形成復合體；該復合體隨后結合到原膜H+-ATP酶基因PePMHA9的啟動子區域，協同激活其轉錄；高表達的PePMHA9蛋白定位在氣孔保衛細胞膜上，通過驅動質子外排、引起膜超極化、促進鉀離子內流等一系列生理過程，最終導致氣孔開度增大；增大的氣孔開度允許更多的CO2進入葉片，從而顯著提升光合作用效率，為毛竹的快速生長和強大固碳能力提供了物質和能量基礎。
這項研究具有多重重要意義。首先，在理論層面，它首次在竹子這一重要的林業和經濟物種中，解析了從光信號感知到氣孔運動執行的完整轉錄調控通路，揭示了其高效光合作用的分子基礎，填補了相關領域的知識空白。其次，在應用層面，鑒定出的PePMHA9、PeWRKY111和PeGLK1-1等關鍵基因，為通過分子育種手段培育具有更高光合效率、更強固碳能力的新竹種提供了寶貴的遺傳資源和分子靶點。最后，在生態層面，增強植物的光合固碳效率是應對全球氣候變化的重要策略之一，該研究為開發基于植物生理調控的碳中和技術提供了新的思路和基因元件。
