在腫瘤的微觀戰場上，癌細胞不僅擅長“偽裝”自己以逃避免疫系統的追殺，還進化出了多種內在機制來促進自身的存活與生長。程序性死亡配體-1（PD-L1）就是癌細胞手中的一張關鍵“王牌”。當它出現在癌細胞表面時，可以與免疫T細胞上的PD-1受體結合，像踩下剎車一樣抑制T細胞的攻擊能力，從而實現免疫逃逸。這也使得針對PD-1/PD-L1軸的免疫檢查點抑制劑（如阿特珠單抗，Atezolizumab）成為癌癥治療的一場革命。然而，越來越多的證據表明，PD-L1的促癌能力遠不止于此。即使在缺乏免疫細胞的腫瘤微環境中，甚至是在癌細胞內部，PD-L1仍能獨立地驅動腫瘤細胞的增殖和生長，這表明PD-L1具有不依賴免疫的、內在的促癌功能。那么，癌細胞是如何精準調控PD-L1蛋白水平，確保其既能發揮免疫抑制功能，又能執行內在促癌信號的呢？這正是當前癌癥生物學領域一個亟待解答的關鍵問題。

與此同時，細胞生物學領域另一個新興熱點——生物分子凝聚體，正在改變我們對細胞內部組織和功能調控的認知。這些由蛋白質、RNA等大分子通過液-液相分離（LLPS）形成的、無膜包裹的動態結構，能夠將特定分子富集在局部區域，從而高效調控基因表達、信號傳導和蛋白質穩定性等多種生命活動。在癌癥中，生物分子凝聚體的失調與多種致癌過程密切相關。其中，一個名為Sequestosome-1（SQSTM1，又稱p62）的多功能支架蛋白，被發現能夠通過LLPS形成生物分子凝聚體，參與多種癌癥的進展。然而，SQSTM1是否會與PD-L1形成“聯盟”，通過凝聚體的形式調控PD-L1的穩定性和功能，進而推動腫瘤生長？這一可能性此前從未被探索。發表在《Journal of Advanced Research》上的一項題為“SQSTM1/p62-mediated PD-L1 biomolecular condensate formation promotes lung tumorigenesis”的研究，正是為了揭開這一謎團。

為探究SQSTM1與PD-L1在肺癌發生中的作用，研究者綜合運用了多項關鍵技術。他們首先通過免疫共沉淀和GST pull-down實驗在多種肺癌細胞系中證實了兩種蛋白的直接相互作用。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建了SQSTM1和PD-L1的基因敲除細胞系，以研究其功能缺失的表型。通過構建一系列SQSTM1截短突變體并結合AlphaFold3蛋白質結構預測模型，確定了SQSTM1中與PD-L1結合的關鍵結構域。采用免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡觀察了SQSTM1/PD-L1生物分子凝聚體的形成與分布。利用小分子化合物1,6-己二醇（1,6-HD）和已獲美國食品藥品監督管理局批準的PD-L1抗體藥物阿特珠單抗來破壞凝聚體，并評估其效果。通過蛋白質穩定性實驗（如環己酰亞胺追蹤、蛋白酶體抑制劑MG132處理）和泛素化分析，探索了PD-L1的降解途徑。最后，研究建立了裸鼠皮下移植瘤模型，在體內驗證了基因敲除和藥物治療對腫瘤生長的抑制作用。研究中使用的細胞系包括H460、A549、H1975以及從臺灣大學醫院新竹分院患者胸水分離的原代PLC26細胞。

研究人員在多個非小細胞肺癌細胞系中，通過免疫共沉淀實驗證實了SQSTM1與PD-L1之間存在直接的蛋白質相互作用。免疫熒光染色進一步顯示，這兩種蛋白在細胞質中呈現共定位，特別是在胞質中富集。通過細胞組分分離實驗，確認了它們的相互作用主要發生在細胞質區域。體外GST pull-down實驗使用從大腸桿菌中純化的重組蛋白，進一步證實了這種相互作用是直接的，而非通過其他細胞因子介導。

為了確定SQSTM1中負責與PD-L1結合的具體區域，研究者利用AlphaFold3進行了蛋白質結構預測，模型顯示SQSTM1的PB1、ZZ、TBS和UBA等多個結構域可能與PD-L1存在相互作用界面。隨后，他們構建了一系列SQSTM1的截短突變體（包括ΔUBA、ΔLIR-UBA、ΔTBS-UBA和ΔPB1）。功能實驗表明，缺失C端結構域（ΔUBA、ΔLIR-UBA、ΔTBS-UBA）的突變體仍然能夠與PD-L1結合，而缺失N端PB1結構域（ΔPB1）的突變體則完全喪失了結合能力。這證明了SQSTM1的PB1結構域是與PD-L1相互作用所必需的。

過表達全長SQSTM1（FL）或保留PB1結構域的截短體（ΔTBS-UBA）能夠顯著提升肺癌細胞中PD-L1的蛋白水平，并促進兩者形成直徑大于1微米的、共定位的生物分子凝聚體。相反，過表達缺失PB1結構域的突變體（ΔPB1）則無法上調PD-L1水平或誘導凝聚體形成。同樣地，利用CRISPR/Cas9技術敲除SQSTM1基因，會導致PD-L1蛋白水平下降。這些結果說明，SQSTM1通過其PB1結構域與PD-L1互作，驅動凝聚體的形成，從而穩定PD-L1。

研究使用了兩種策略來破壞SQSTM1/PD-L1凝聚體。一是應用破壞LLPS的化學試劑1,6-己二醇（1,6-HD），它能夠溶解已形成的凝聚體，并劑量依賴性地降低PD-L1蛋白水平，同時抑制細胞活力。二是使用抗PD-L1的抗體藥物阿特珠單抗，處理細胞后同樣觀察到了SQSTM1/PD-L1凝聚體的解聚和PD-L1水平的下降。這表明，靶向破壞這種凝聚體是降低PD-L1水平的一種有效策略。

蛋白質穩定性實驗發現，在SQSTM1敲除的細胞中，PD-L1的半衰期縮短，對蛋白質合成抑制劑環己酰亞胺（CHX）更為敏感。蛋白酶體抑制劑MG132的處理可以挽救SQSTM1敲除導致的PD-L1降解。進一步的泛素化分析顯示，當SQSTM1與PD-L1結合時（例如過表達全長SQSTM1），PD-L1上的K48連接型多聚泛素化修飾減少；而當兩者的相互作用被破壞（例如過表達ΔPB1突變體）時，PD-L1的K48泛素化水平顯著增加。K48連接的多聚泛素化鏈是引導蛋白質進入蛋白酶體降解的主要信號。因此，該結果證實SQSTM1通過與PD-L1結合形成凝聚體，保護其免遭泛素-蛋白酶體途徑的降解。

功能實驗表明，敲除SQSTM1或PD-L1均能顯著抑制肺癌細胞的增殖。機制上，敲除任一基因都會導致細胞增殖關鍵蛋白Survivin（存活蛋白）及其磷酸化形式（p-survivin^T34）和細胞周期蛋白CDK1的表達下調。更重要的是，在裸鼠皮下移植瘤模型中，與對照組相比，敲除SQSTM1或PD-L1的腫瘤生長速度明顯減緩，最終形成的腫瘤體積更小。對腫瘤組織的分析顯示，在對照組的腫瘤中存在明顯的SQSTM1/PD-L1凝聚體，而敲除組的腫瘤中則觀察不到。這表明SQSTM1/PD-L1凝聚體在體內外均能促進腫瘤生長。

體內藥效實驗進一步驗證了靶向該凝聚體的治療潛力。在攜帶野生型H1975腫瘤的裸鼠中，阿特珠單抗治療能顯著抑制腫瘤生長；然而，在攜帶SQSTM1敲除的H1975腫瘤的裸鼠中，阿特珠單抗的抑瘤效果則不明顯。對腫瘤組織的免疫熒光分析證實，阿特珠單抗處理能有效破壞野生型腫瘤中的SQSTM1/PD-L1凝聚體，但在敲除腫瘤中無此效應。這表明，阿特珠單抗的抗腫瘤作用至少部分依賴于其對SQSTM1/PD-L1凝聚體的破壞，揭示了該抗體藥物一種不依賴于免疫系統的新型作用機制。

本研究系統性地揭示了SQSTM1/p62通過其PB1結構域與PD-L1直接相互作用，并驅動兩者形成生物分子凝聚體。這種凝聚體結構猶如一個“保護罩”，能夠將PD-L1隔離在細胞質內，使其免受由K48連接的多聚泛素化標記所介導的蛋白酶體降解，從而穩定了PD-L1的蛋白水平。穩定的PD-L1進而通過上調Survivin等促增殖蛋白的表達，獨立于其免疫檢查點功能，直接促進肺癌細胞的增殖和體內腫瘤的生長。研究創新性地將癌癥生物學中的兩個重要概念——生物分子凝聚體和PD-L1的腫瘤內在功能——聯系起來，為理解PD-L1的促癌機制提供了全新視角。

研究的另一個重要發現在于其臨床轉化意義。研究證明，已上市的PD-L1抗體藥物阿特珠單抗能夠破壞SQSTM1/PD-L1凝聚體，并且其在動物模型中的抗腫瘤效果依賴于SQSTM1的存在。這提示，除了眾所周知的阻斷PD-1/PD-L1免疫檢查點通路外，抗體藥物還可能通過瓦解腫瘤細胞內部的促生存信號復合物來發揮療效。此外，能夠破壞LLPS的小分子化合物（如1,6-HD）也為開發靶向此類凝聚體的新型抗癌藥物提供了思路。最后，基于公共數據庫的分析顯示，高表達的SQSTM1和PD-L1均與肺癌患者的不良預后顯著相關，進一步支持了該通路的臨床相關性。

總之，這項研究不僅闡明了SQSTM1/PD-L1生物分子凝聚體在肺腫瘤發生中的關鍵作用及分子機制，還驗證了靶向破壞該凝聚體作為一種潛在治療策略的可行性。它拓展了我們對PD-L1生物學功能的認識，并為改善現有免疫治療療效及開發新型抗癌療法提供了重要的理論依據和新靶點。