肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因，其中非小細胞肺癌(NSCLC)約占85%。盡管手術、放化療和免疫治療取得了進展，但晚期患者的治療選擇仍然有限，療效欠佳，迫切需要開發(fā)新的抗癌藥物。受體酪氨酸激酶EphB4在多種癌癥中過表達，被認為是腫瘤生長的促進因子和潛在的治療靶點。然而，其在肺癌發(fā)展中的具體作用及其調控機制尚不明確，這成為了一個亟待填補的知識缺口。與此同時，源于植物(如博落回、白屈菜、血根草)的天然化合物血根堿(Sanguinarine, Sang)已被證明在乳腺癌、前列腺癌和結直腸癌中具有抗癌特性，但其在肺癌中的作用機制，特別是是否靶向EphB4相關通路，仍是未知數(shù)。為此，來自浙江大學醫(yī)學院附屬人民醫(yī)院的研究團隊開展了一項研究，旨在揭示EphB4在肺癌進展中的功能，評估Sang作為EphB4特異性抑制劑的潛力，并闡明其分子機制。該研究成果發(fā)表在《Journal of Advanced Research》上。

為了回答上述問題，研究人員綜合運用了生物信息學分析、分子對接與動力學模擬、細胞功能實驗(如MTT、克隆形成、Transwell遷移、劃痕實驗)、蛋白質相互作用研究(如免疫共沉淀、泛素化分析)、以及裸鼠皮下移植瘤模型等關鍵技術方法。研究使用了來自浙江人民醫(yī)院的7對肺癌患者樣本及配對癌旁組織，并在多種肺癌細胞系(如H1299, H522)中進行了驗證。

研究人員通過分析TCGA等公共數(shù)據(jù)庫和肺癌患者組織樣本發(fā)現(xiàn)，EphB4在肺癌腫瘤組織中的表達量顯著高于癌旁正常組織，且高表達與患者不良預后相關。在肺癌細胞系中，EphB4同樣高表達。功能實驗表明，過表達EphB4(EphB4-OE)或用其配體EphrinB2 Fc激活，能顯著促進肺癌細胞(H1299, H522)的增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力，證實了EphB4在肺癌中的致癌作用。

通過虛擬篩選近2萬種天然化合物，Sang以最高的對接得分(-10.115 kcal/mol)被確定為與EphB4結合的最佳候選分子。體外結合實驗(微尺度熱泳動，MST)證實Sang與EphB4蛋白具有高親和力(250 nM)。分子動力學模擬顯示Sang與EphB4的結合穩(wěn)定。在功能上，Sang能以劑量依賴的方式抑制肺癌細胞增殖，并顯著減少克隆形成。在H522細胞裸鼠移植瘤模型中，Sang治療(3和6 mg/kg)可分別使腫瘤體積減小70%，腫瘤質量減少60%，且未觀察到明顯毒性。

研究發(fā)現(xiàn)，EphB4過表達的肺癌細胞對Sang處理更敏感。在體內，Sang能顯著抑制EphB4過表達的H1299細胞移植瘤的生長。Transwell和劃痕實驗表明，Sang能有效抑制肺癌細胞的遷移和侵襲，且在EphB4過表達或EphrinB2 Fc激活的細胞中抑制作用更強。即使在使用TGF-β(轉化生長因子-β)誘導上皮-間質轉化(EMT)和遷移增強的條件下，Sang也能有效抑制這種促遷移效應，并且與已知的EphB4激酶抑制劑NVP-BHG712聯(lián)用具有協(xié)同作用。

通路富集分析和基因本體(GO)分析提示EphB4與β-連環(huán)蛋白(β-catenin)結合相關。TCGA數(shù)據(jù)和免疫組化證實，在肺癌組織中EphB4與β-連環(huán)蛋白的表達呈正相關。分子對接揭示了EphB4與β-連環(huán)蛋白相互作用的可能界面。機制上，Sang直接結合EphB4，抑制其磷酸化，并破壞EphB4與β-連環(huán)蛋白之間的相互作用。這導致β-連環(huán)蛋白的磷酸化水平增加，進而被泛素化并通過蛋白酶體途徑降解。免疫熒光和Western blot結果顯示，Sang處理能阻止β-連環(huán)蛋白向細胞核內轉移，降低其總蛋白水平，并增加其磷酸化形式(p-β-catenin)的比例。

由于EphB4-β-連環(huán)蛋白信號驅動EMT，研究人員進一步檢測了EMT相關標志物。Sang處理可上調上皮標志物E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達，同時下調間質轉錄因子Snail以及基質金屬蛋白酶MMP2和MMP9的表達。在TGF-β刺激的促EMT條件下，Sang能有效逆轉這些EMT相關分子的變化，且與NVP-BHG712聯(lián)用效果更佳。此外，Sang還能抑制血管內皮生長因子VEGFA的表達，提示其可能同時具有抗血管生成作用。

深入機制研究表明，Sang能以劑量依賴的方式抑制EphB4的磷酸化。分子對接顯示，Sang結合在EphB4酪氨酸激酶結構域的ATP結合口袋中，與關鍵氨基酸殘基(如LYS-647, ARG-763)形成氫鍵，從而穩(wěn)定其非活性構象。研究還發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長因子II(IGF-II)信號可通過磷酸化EphB4第987位酪氨酸(Tyr987)來保護EphB4免于降解。而Sang能夠抑制IGF-II的表達和EphB4在Tyr987位點的磷酸化，從而促進EphB4發(fā)生多聚泛素化，并通過蛋白酶體途徑被降解。這種促進EphB4降解的機制是Sang所特有的，因為激酶抑制劑NVP-BHG712并未表現(xiàn)出此效應。

本研究系統(tǒng)闡明了EphB4在肺癌進展中的關鍵作用。EphB4在肺癌中高表達，并通過配體非依賴性的方式促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。更重要的是，研究首次發(fā)現(xiàn)天然化合物血根堿(Sang)是一種新型、高效的EphB4抑制劑。

Sang通過一種前所未有的雙重機制發(fā)揮抗腫瘤作用：首先，它直接結合EphB4的ATP口袋，抑制其激酶活性；其次，它通過抑制IGF-II介導的EphB4磷酸化(Tyr987)，促進EphB4的泛素化和蛋白酶體降解。這種對EphB4蛋白水平的直接下調，與單純抑制其激酶活性的藥物(如NVP-BHG712)的作用機制不同，二者甚至可能產(chǎn)生協(xié)同效應。

在信號傳導層面，Sang破壞EphB4與β-連環(huán)蛋白的相互作用，導致β-連環(huán)蛋白磷酸化、泛素化并最終被降解。這進而抑制了β-連環(huán)蛋白的核轉位及其下游靶基因(如Snail, MMPs)的轉錄，從而逆轉上皮-間質轉化(EMT)，抑制腫瘤的遷移、侵襲和血管生成(VEGFA下調)。

這項研究的意義重大。它不僅明確了EphB4作為肺癌治療新靶點的價值，還為臨床轉化提供了一個極具前景的候選藥物——血根堿。Sang源于天然產(chǎn)物，在臨床前模型中顯示出強效的抗腫瘤活性和良好的安全性。其獨特的作用機制(促進靶蛋白降解)為開發(fā)EphB4靶向療法提供了新思路。未來，針對EphB4高表達患者的生物標志物驅動臨床試驗，以及Sang與現(xiàn)有療法(如化療、免疫治療或其他靶向藥)的聯(lián)合應用探索，將有望為肺癌患者帶來新的治療希望。當然，研究也存在一定局限，如患者樣本量較小，EphB4配體依賴性信號在肺癌中的復雜角色也有待未來進一步研究。盡管如此，這項結合計算預測與嚴格實驗驗證的研究，為Sang作為肺癌治療藥物的臨床開發(fā)提供了堅實的臨床前依據(jù)。