本綜述概述了當前用于細胞療法的免疫細胞分離技術。我們將探討密度梯度離心法、MACS和FACS等方法，并討論它們的優勢和局限性。細胞富集（增加目標群體的相對豐度）與細胞分選（基于多參數分析精確分離特定亞群體，通常能達到非常高的純度）之間存在顯著區別。文中將重點介紹用于治療的幾種關鍵免疫細胞類型，包括T淋巴細胞、NK細胞、B細胞、單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞，并提供具體的實驗方案和研究。同時，我們還將討論分離后的細胞表征以及關鍵質量屬性（CQAs）和評估方法。最后，我們還將探討免疫細胞分離的未來方向和新興技術，并提供比較各種技術及其應用的總結表。
基于細胞的免疫療法是腫瘤學和再生醫學中的革命性方法，它利用免疫系統的精確性來特異性地靶向癌癥。嵌合抗原受體（CAR）-T細胞療法在治療難治性血液系統惡性腫瘤方面的臨床成功——在B細胞急性淋巴細胞白血病中實現了40-90%的緩解率——驗證了“活藥物”的概念（Groth等人，2025年）。這些療法是從患者體內通過白細胞分離得到的免疫細胞開始開發的，在體外進行工程改造后重新輸回患者體內（Groth等人，2025年）。除了CAR-T細胞外，現有的療法還包括自然殺傷（NK）細胞療法。這些療法利用NK細胞天然的、不受主要組織相容性復合體（MHC）限制的細胞毒性，使其適用于“即用型”應用，并降低了移植物抗宿主病（GvHD）的風險（Groth等人，2025年；Dan和Kang-Zheng，2025年；Peltier等人，2025年；Hadiloo等人，2023年）。此外，腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）療法最近獲得了FDA的批準，用于晚期黑色素瘤治療，產品名為lifileucel（Iovance Biotherapeutics）；值得注意的是，這是首個獲批準的TIL產品，它來源于切除的腫瘤標本（Groth等人，2025年；Stoops等人，2025年）。其他創新還包括工程化的巨噬細胞（CAR-M）和樹突狀細胞（DC）疫苗，它們分別通過改變腫瘤微環境來刺激抗腫瘤免疫（Groth等人，2025年；Wang等人，2022a）。然而，當CAR-T療法用于實體瘤時，會遇到免疫抑制微環境、抗原異質性和細胞因子釋放綜合征（CRS）等不良效應的挑戰（Groth等人，2025年；Esmaeilzadeh等人，2025年）。此外，針對組織駐留記憶T細胞的新療法在以組織特異性方式分離這些細胞方面也存在困難（Stoops等人，2025年）。細胞療法平臺的多樣化凸顯了標準化、可擴展制造過程的迫切需求，因為高質量的細胞分離對于確保產品一致性和臨床療效至關重要（Wang等人，2022a；Shillingford等人，2025年）。
免疫細胞分離是治療生產中的關鍵步驟，因為它決定了產品的安全性、效力和合規性。在CAR-T細胞生產中，實現高純度的分離至關重要；例如，殘留的單核細胞（超過2%）會通過分泌前列腺素E?抑制T細胞的擴增（Groth等人，2025年），而B細胞雜質可能導致溶血反應，在B細胞惡性腫瘤的情況下，還可能使白血病B細胞發生轉導，從而導致產品污染（Shillingford等人，2025年；Atre和Reid，2025年）。在異基因NK細胞療法中，即使僅有0.1%的T細胞污染也可能導致致命的GvHD（Groth等人，2025年；Dan和Kang-Zheng，2025年；Peltier等人，2025年）。分離技術必須確保細胞的活力和功能得以保留。熒光激活細胞分選（FACS）等過程中產生的機械應力主要與剪切應力引起的細胞死亡有關；然而，在分選過程中受體結合和激活信號也可能導致激活誘導的細胞死亡（AICD）和表面受體表達的改變。同樣，抗體介導的選擇可能會無意中激活T細胞，導致其耗竭。酶消化還可能降解重要的歸巢受體，如組織駐留T細胞上的CXCR3（Stoops等人，2025年；Shillingford等人，2025年）。分離效果不佳可能會帶來嚴重的后果。例如，通過酶法分離的腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）可能表現出較低的細胞毒性（Stoops等人，2025年），而通過黏附純化的單核細胞則可能導致樹突狀細胞分化受損（Matsushita等人，2007年）。因此，在選擇分離技術（如密度梯度離心法、磁激活細胞分選（MACS）或FACS）時，必須在純度、產量、活力和功能保留之間取得平衡，并遵守GMP標準。在這種情況下，高通量方法如MACS通常用于初步富集細胞群體，而FACS則用于精確分選特定的、往往稀有的亞群體，以用于分析或關鍵的生產過程。新興的解決方案，如封閉式自動化MACS系統，提高了重復性，同時確保符合監管標準（Shillingford等人，2025年）。
免疫細胞分離技術
從外周血和骨髓等復雜來源中分離出特定、存活且功能完整的免疫細胞對于確保細胞療法的生產效果和安全性至關重要。所使用的分離技術直接影響最終產品的純度、產量、活力和功能完整性。需要區分兩種基本類型的細胞分離過程：富集（分離）和分選。
T淋巴細胞分離：策略和臨床優化
為B細胞急性淋巴細胞白血病（B-ALL）患者生產自體CAR-T細胞的第一步也是最重要的一步是從白細胞分離產物中特異性富集T淋巴細胞。這一步驟對于最小化無意中用CAR構建體轉導殘留的白血病B細胞的風險至關重要，因為這可能導致CAR表達的腫瘤細胞的形成（Atre和Reid，2025年）。用于這種富集的方法已經不斷發展。
關鍵質量屬性（CQAs）和基因組安全性評估
對免疫細胞產品進行全面表征對于確保細胞療法的安全性、有效性和一致性至關重要。關鍵質量屬性（CQAs）是直接影響產品性能的可測量指標。基因修飾療法需要特別關注轉導效率和載體拷貝數（VCN）。轉導效率通常通過流式細胞術或分子方法進行量化，表示被轉導的細胞百分比。
技術和制造障礙
各種因素顯著影響細胞療法的產品質量、一致性和臨床可擴展性。一個主要的技術障礙是在整個分離過程中保持細胞的活力和功能完整性。物理應力，如在FACS（熒光激活細胞分選）過程中經歷的剪切力、MACS（磁激活細胞分選）過程中的機械操作，以及暴露于抗體或密度梯度介質中，都可能損害細胞膜完整性。
CAR-T細胞生產——定義起始T細胞群體
自體CAR-T細胞的生產對白細胞分離產品的組成非常敏感。特別是，起始材料中高水平的單核細胞（CD14+）或CD4+CD25+ Tregs會顯著影響T細胞的激活和基因轉移。例如，研究表明，去除CD14+單核細胞（這些細胞會吞噬抗CD3/CD28激活珠子，從而限制T細胞刺激）可以將早期激活水平提高一倍，并將CAR轉導效率提高多達60%（Ayala等人）。
未來方向和建議
通過技術創新、改進的表征方法和標準化的制造過程，免疫細胞分離在細胞療法領域的前景充滿希望。這些發展旨在克服當前的限制，滿足日益增長的臨床需求。下一代分離技術專注于封閉系統、自動化平臺，以減少手動操作，降低污染風險，并提高過程一致性。
結論
本綜述表明，高保真的免疫細胞分離是有效細胞療法的基礎，技術選擇直接決定了產品的安全性、效力和臨床轉化能力。雖然密度離心法、MACS和FACS等成熟方法提供了可靠的分離框架，但它們仍面臨挑戰，包括抗體介導的激活導致的功能下降、可擴展性限制以及物種間的差異。新興技術有望解決這些問題。
資金披露
本研究未獲得公共部門、商業部門或非營利組織的任何特定資助。
倫理合規性
作為對已發表文獻的全面分析，本綜述不需要進行涉及人類或動物的原始研究，因此無需機構倫理委員會的批準。
AI輔助披露
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CRediT作者貢獻聲明
馬蘇德·哈桑扎德·馬庫伊（Masoud Hassanzadeh Makoui）：撰寫——審閱與編輯、初稿撰寫、可視化、驗證、調查、數據整理、概念化。阿米爾·巴亞特·博達吉（Amir Bayat Bodaghi）：初稿撰寫、調查。穆罕默德·阿明·拉扎維（Mohammad Amin Razavi）：初稿撰寫、調查。阿爾曼·塔蘭（Arman Taran）：初稿撰寫、調查。阿米爾·普亞·阿克巴里（Amir Pooya Akbari）：初稿撰寫、調查。穆罕默德·巴赫拉米（Mohammad Bahrami）：初稿撰寫、調查。阿卜杜勒雷扎·埃斯梅伊爾扎德（Abdolreza Esmaeilzadeh）：審閱。
利益沖突聲明
所有作者聲明沒有財務或非財務利益沖突。
致謝
作者對所有在免疫細胞分離技術和表征方法方面做出開創性工作的研究人員表示衷心的感謝。
