《Poultry Science》：Co-immunization with two recombinant Newcastle disease viruses expressing ILTV gB and H9N2 AIV HA confers protective efficacy against three avian pathogens
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本研究針對家禽生產(chǎn)中新城疫、H9N2禽流感和傳染性喉氣管炎（ILT）多重感染嚴(yán)重、防控成本高昂的難題，創(chuàng)新性地采用熱穩(wěn)定新城疫病毒（TS09-C）為載體，構(gòu)建并共免疫了表達(dá)H9N2病毒HA蛋白（rTS-H9）和ILTV gB蛋白（rTS-gB）的重組病毒。結(jié)果表明，聯(lián)合免疫在家禽中能誘導(dǎo)非干擾的有效體液免疫應(yīng)答，并提供針對三種病原體的全面保護，顯著減輕臨床癥狀和病毒脫落。這項工作為開發(fā)新型多聯(lián)疫苗、簡化家禽免疫程序提供了高效可行的方案。
在家禽密集養(yǎng)殖的今天，多種呼吸道病毒（如新城疫病毒、H9N2亞型禽流感病毒和傳染性喉氣管炎病毒）同時流行已成為一個嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。它們不僅各自能導(dǎo)致嚴(yán)重的呼吸道疾病，還存在協(xié)同致病作用，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。傳統(tǒng)的防控策略依賴生物安全和疫苗接種，但現(xiàn)有疫苗各有局限：傳統(tǒng)的滅活疫苗雖安全，但難以有效誘導(dǎo)黏膜免疫，且成本較高、需注射接種；而活減毒疫苗雖有較好的免疫效果，卻存在毒力返強、潛伏感染和母源抗體干擾等生物安全風(fēng)險。更為棘手的是，當(dāng)前的商業(yè)生產(chǎn)需要依次接種多種不同的疫苗才能獲得廣譜保護，這種繁瑣的免疫程序顯著增加了成本。因此，開發(fā)能夠一次免疫、同時預(yù)防多種疾病的新型高效疫苗，成為禽病防控領(lǐng)域亟待突破的瓶頸。
在這一背景下，研究人員將目光投向了以新城疫病毒（NDV）為載體的重組疫苗。NDV作為一種單股負(fù)鏈RNA病毒，因其良好的安全性、易于通過黏膜途徑（如噴霧、飲水）大規(guī)模免疫，并能誘導(dǎo)全面免疫應(yīng)答的優(yōu)勢，被視為理想的疫苗載體平臺。基于這些考量，近期發(fā)表在《Poultry Science》上的一項研究，就深入探索了利用兩種重組新城疫病毒進(jìn)行聯(lián)合免疫，以同時防控三種主要禽類病毒的可能性。
為了開展此項研究，研究人員主要采用了以下關(guān)鍵技術(shù)方法：首先，基于熱穩(wěn)定的NDV TS09-C毒株，利用反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建了兩種重組病毒——表達(dá)H9N2禽流感病毒HA蛋白的rTS-H9和表達(dá)傳染性喉氣管炎病毒gB蛋白的rTS-gB。研究分別使用無特定病原體（SPF）雞和商業(yè)雞（包含母源抗體）建立了動物模型。通過間接免疫熒光、蛋白質(zhì)免疫印跡和病毒滴度測定評估了兩種重組病毒在細(xì)胞水平共感染的相互干擾情況。通過血凝抑制試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗監(jiān)測免疫后雞只的特異性抗體水平。最后，通過以H9N2 DY0602株、ILTV WG株或NDV F48E9株進(jìn)行攻毒實驗，系統(tǒng)評價了聯(lián)合免疫對臨床癥狀、組織病理學(xué)損傷、組織病毒載量以及病毒排毒的保護效力。
研究結(jié)果全面驗證了聯(lián)合免疫策略的有效性：
1. Coinfection with rTS-H9 and rTS-gB does not affect viral growth or protein expression in vitro
體外共感染實驗證實，rTS-H9和rTS-gB在BHK-21細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞中共同感染時，兩種病毒的復(fù)制動力學(xué)以及外源蛋白（HA和gB）的表達(dá)水平，與各自單獨感染組相當(dāng)。蛋白質(zhì)免疫印跡分析也顯示，共感染細(xì)胞中HA和gB蛋白的表達(dá)量沒有差異。這些結(jié)果表明，這兩種重組病毒在體外沒有表現(xiàn)出顯著的相互干擾。
2. Co-immunization with rTS-H9 and rTS-gB elicits noninterfering humoral immune responses against three viral targets in SPF chickens
通過滴鼻/點眼的途徑對SPF雞進(jìn)行聯(lián)合免疫后，其血清中產(chǎn)生的針對NDV、H9N2 AIV和ILTV的特異性抗體滴度與單一病毒免疫組相當(dāng)，沒有統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異。這證明聯(lián)合免疫能夠在雛雞中誘導(dǎo)針對三種靶標(biāo)病毒的非干擾性體液免疫應(yīng)答。
3. Co-immunization alleviates clinical symptoms, reduces mortality, and decreases tissue viral loads following challenge with three pathogens in SPF chickens
攻毒保護實驗顯示，聯(lián)合免疫提供了與單苗免疫同等的保護效力。例如，在攻毒后，免疫組雞只的臨床癥狀更輕、死亡率更低。通過定量PCR測定，免疫雞只在攻毒后第3天的呼吸道和消化道組織（如氣管、肺、十二指腸、喉頭）中的病毒載量顯著低于磷酸鹽緩沖鹽水對照組。
4. Co-immunization reduces histopathological damage following challenge with three pathogens in SPF chickens
組織病理學(xué)分析進(jìn)一步證實了疫苗的保護效果。例如，在H9N2攻毒后，免疫組雞只保持了正常的肺泡結(jié)構(gòu)和十二指腸絨毛結(jié)構(gòu)，而對照組則出現(xiàn)了嚴(yán)重的間質(zhì)出血和腺體壞死等病變。在ILTV和NDV攻毒后，也觀察到了類似的組織保護效應(yīng)。
5. Co-immunization reduces viral shedding following challenge with three pathogens in SPF chickens
病毒排毒是評價疫苗效力的關(guān)鍵指標(biāo)。研究通過采集氣管和泄殖腔拭子進(jìn)行病毒檢測發(fā)現(xiàn)，無論是哪種病毒攻毒，聯(lián)合免疫組的雞只病毒排毒率和排毒量均顯著低于對照組，且排毒持續(xù)時間更短，在攻毒后第7天基本檢測不到病毒，而對照組則持續(xù)排毒。
6. Co-immunization with rTS-H9 and rTS-gB confers robust immune protection in commercial chickens
為了評估聯(lián)合免疫在實際養(yǎng)殖中的應(yīng)用潛力，研究還對帶有高水平母源抗體的1日齡商業(yè)雞進(jìn)行了噴霧免疫。結(jié)果顯示，聯(lián)合免疫能夠有效克服母源抗體的干擾，誘導(dǎo)出有效的抗體反應(yīng)。攻毒后，免疫雞同樣表現(xiàn)出顯著減輕的臨床癥狀、更低的組織病毒載量和病毒排毒率，其保護效果與單苗免疫組無顯著差異。
綜上所述，這項研究通過系統(tǒng)的體外和體內(nèi)實驗，證實了基于熱穩(wěn)定TS09-C株的兩種重組新城疫病毒（rTS-H9和rTS-gB）進(jìn)行聯(lián)合免疫的可行性。該策略在細(xì)胞水平無相互干擾，在SPF雞和商業(yè)雞中均能誘導(dǎo)出強效且非干擾的體液免疫，并對NDV、H9N2 AIV和ILTV三種病原體的強毒攻擊提供與單苗免疫相當(dāng)?shù)挠行ПＷo。更重要的是，這種噴霧共免疫的方式適用于存在母源抗子的商業(yè)雛雞，且熱穩(wěn)定的特性使其更適應(yīng)大規(guī)模養(yǎng)殖場的環(huán)境。這項研究成果不僅為使用NDV載體疫苗進(jìn)行聯(lián)合免疫提供了堅實的理論依據(jù)，也為在多種禽類病原體共存的地區(qū)，提供了一種更便捷、高效的“一針多防”免疫控制新策略，具有重要的實踐意義和應(yīng)用前景。
