《Bioresource Technology》：Production of pure all-trans retinal from agricultural byproducts by metabolically engineered
Corynebacterium glutamicum using two-phase cultivation
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純視黃醇生物合成新策略：代謝工程改造枯草芽孢桿菌耦合兩相培養系統，利用糖蜜為原料實現高效生產（104.9 mg/L）且無其他視黃類物質污染，突破化學合成局限推動綠色制造。
郝文輝|山田俊吾|平野洋子-原|原清隆|辻陽太
金澤大學前沿科學研究所，金澤市角馬町，石川縣920-1192，日本
摘要
視黃醇類化合物包括視黃醛、視黃醇（維生素A）和視黃酸，屬于維生素A及其生物活性代謝物，廣泛應用于制藥、醫療和化妝品領域。其中，視黃醛因具有高生物效價和低皮膚刺激性的良好組合，以及強大的抗菌活性，在護膚應用中受到越來越多的關注。然而，微生物生產視黃醛通常會產生與其他視黃醇類化合物的混合物，并且需要昂貴的培養基。本文報道了利用經過代謝工程改造的Corynebacterium glutamicum從農業副產品中純化視黃醛的方法。通過阻斷下游代謝途徑并增強類胡蘿卜素生物合成，構建了一種能夠生產視黃醛的菌株。為了將番茄紅素轉化為視黃醛，引入了兩個相關基因。由于視黃醛具有脂溶性且易氧化的特性，本研究采用了使用和丁基羥基甲苯的兩相培養系統進行原位提取和穩定處理。實驗確定視黃醛生產的最佳溫度為21°C，其產量是最佳生長溫度30°C時的2.6倍。以糖蜜作為碳源和維生素來源，搖瓶培養可產出生物量濃度為30.7 mg/L的視黃醛（基于水相體積計算），且未產生其他視黃醇類化合物。在2.5升罐式發酵器中進行的大規模培養中，同樣僅從糖蜜中獲得了104.9 mg/L的視黃醛（在相中的濃度為2,099 mg/L），且未生成其他視黃醇類化合物。本研究展示了一種利用可再生資源生產純視黃醛的經濟高效且可持續的生物方法，為工業化生產奠定了基礎。
引言
視黃醇類化合物（包括全反式視黃醛、全反式視黃醇和全反式視黃酸）在多種生理過程中發揮著關鍵作用，如保護視力、調節細胞增殖和更新以及維持大腦功能（Clagett-Dame和Knutson，2011；álvarez等人，2014）。這些特性使得它們被廣泛用于護膚品、醫療產品和藥品中，預計其復合年增長率將達到6.5%，到2033年市場規模將增長至30.5億美元（Louren?o等人，2024）。
在護膚應用中，視黃酸表現出強大的生物活性，例如促進細胞更新和遷移，以及刺激膠原蛋白和糖胺聚糖的合成，從而具有顯著的抗衰老效果（Konisky等人，2024）。然而，由于其強烈的皮膚刺激性，視黃酸僅限處方使用。因此，需要經過兩次酶促轉化（先轉化為視黃醛再轉化為視黃酸）的視黃醇被廣泛用于非處方護膚品中。從2025年起，歐盟規定身體乳液中視黃醇的最大允許濃度為0.05%，而在所有其他涂抹型和沖洗型化妝品中則為0.3%（EU 2024/996）。這一監管變化使得視黃醛成為一種有前景的替代品，因為其生物利用度大約是視黃醇的十倍，且皮膚刺激性相對較低（Konisky等人，2024）。此外，視黃醛對引起痤瘡的丙酸桿菌具有最強的抗菌活性（Pechère等人，1999），這一特性預計將進一步增加其在護膚行業的吸引力。
目前，商業上的視黃醛主要通過化學合成石油衍生原料來生產（Parker等人，2016）。鑒于建立碳中和社會的需求日益增加，使用可再生生物質通過微生物發酵進行生物合成變得至關重要。已有研究利用大腸桿菌、釀酒酵母和Yarrowia lipolytica實現了視黃醛的微生物生產（Jang等人，2011；Jang等人，2015；Park等人，2022；Sun等人，2019；Hu等人，2022）。特別是在釀酒酵母中，通過整合β-胡蘿卜素途徑和編碼β-胡蘿卜素15,15′-雙加氧酶（BCMO）的基因，并采用進行兩相培養，成功實現了每升2,094 mg的視黃醛產量和1,256 mg的視黃醇產量（Sun等人，2019）。然而，大多數研究報道的產物都是視黃醛與其他視黃醇類的混合物，這可能是由于宿主微生物中存在內源性脫氫酶。在實際應用中，需要純視黃醛而不含其他視黃醇類化合物（Hu等人，2022）。為此，通過刪除四個醇脫氫酶基因和一個醛脫氫酶基因對釀酒酵母進行了代謝工程改造，從而防止視黃醛轉化為視黃醇和視黃酸，實現了69.13 mg/L的純視黃醛積累（Mo等人，2022）。此外，在大腸桿菌中敲除編碼醛還原酶的ybbO基因后，減少了視黃醇的生成并提高了視黃醛的產量。通過對甲瓦酮途徑進行系統代謝工程改造，并通過敲除七個關鍵代謝基因將碳流重新導向乙酰輔酶A，視黃醛的產量提升至245.73 mg/L（Liu等人，2025）。然而，大多數關于微生物視黃醛生產的研究依賴于昂貴的培養基、維生素和精制糖，這些因素限制了其工業化進程。
Corynebacterium glutamicum是一種革蘭氏陽性、兼性厭氧細菌，廣泛用于生產多種有用的化學物質，如氨基酸、二胺、有機酸和醇類（Becker等人，2018；Tsuge和Matsuzawa，2021）。C. glutamicum還能自然產生C50類胡蘿卜素脫普倫諾黃質，該化合物通過非甲瓦酮途徑和類胡蘿卜素途徑合成（Heider等人，2012；Henke等人，2017）。利用這一特性，C. glutamicum已被用于生產番茄紅素、β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素和蝦青素等類胡蘿卜素，顯示出作為類胡蘿卜素生產微生物平臺的潛力（Heider等人，2014；Li等人，2021）。然而，C. glutamicum》尚未被用于生產視黃醇類化合物。
糖蜜是糖工業的副產品，其營養成分復雜（Zhang等人，2021）。它含有豐富的碳水化合物，其中蔗糖為主要成分（Khatun等人，2021），同時還含有氨基酸、維生素、無機鹽和微量元素（El Asri和Farag，2023）。重要的是，糖蜜的成本僅約為精制葡萄糖的40%（Ma等人，2023），使其成為包括C. glutamicum在內的微生物生長的廉價且有效的碳源，因此在利用C. glutamicum進行氨基酸工業生產中得到廣泛應用（Jamir等人，2021；Zheng等人，2021）。
在本研究中，我們探討了利用C. glutamicum作為宿主，以糖蜜為碳源和維生素來源，經濟高效地生產純視黃醛的潛力。通過將兩個異源基因引入經過廣泛改造的番茄紅素生產菌株中，構建了能夠生產視黃醛的菌株，并優化了培養條件以實現高效生產。最后，在2.5升生物反應器中進行了大規模生產。據我們所知，這是首次利用C. glutamicum以及廉價合成培養基生產純視黃醛的報道。
菌株與培養
本研究使用的所有細菌菌株和質粒列于表S1中。大腸桿菌菌株在37°C下于Luria–Bertani培養基中培養。除非另有說明，C. glutamicum ATCC 13032及其衍生菌株在30°C下于添加了2%（w/v）葡萄糖或蔗糖的brain–heart infusion（BHI）培養基中培養。必要時，會在培養基中添加卡那霉素（大腸桿菌 50 μg/mL，C. glutamicum 25 μg/mL）。微孔板上的細胞生長情況如下
優化代謝途徑以構建高產番茄紅素的菌株
C. glutamicum能夠合成類胡蘿卜素脫普倫諾黃質，該化合物會導致細胞呈現黃色（Heider等人，2012）。該化合物的合成始于1-脫氧-x-木酮糖-5-磷酸，而1-脫氧-x-木酮糖-5-磷酸是由甘油醛-3-磷酸（G3P）和丙酮酸作為前體合成的（圖1）。通過由八步酶促反應組成的非甲瓦酮途徑，脫普倫諾黃質進一步通過類胡蘿卜素生物合成途徑中的五個反應生成
結論
本研究通過增強前體供應、采用兩相培養系統以及優化培養條件，實現了利用可再生生物質經濟高效地生產純視黃醛的目標。經過改造的菌株在以糖蜜為碳源的廉價合成培養基中進行批式發酵，產出了每升104.9 mg的純視黃醛（在相中的濃度為2,099 mg）。這些發現表明
作者貢獻：CRediT
WH負責研究、驗證和初稿撰寫；SY負責驗證；YHH負責監督和資源提供；KYH負責監督和資源提供；YT負責概念設計、研究、資金獲取、項目管理和撰寫及審稿編輯。
CRediT作者貢獻聲明
郝文輝：初稿撰寫、驗證和研究。山田俊吾：驗證。平野洋子-原：監督和資源提供。原清隆：監督、資源提供和概念設計。辻陽太：撰寫和審稿編輯、項目管理和資金獲取、概念設計。
利益沖突聲明
作者聲明以下可能構成潛在利益沖突的財務利益和個人關系：辻陽太持有金澤大學的專利申請；郝文輝持有金澤大學的專利申請；原清隆持有靜岡大學的專利申請。如果還有其他作者，他們聲明沒有已知的可能影響本文工作的財務利益或個人關系。
致謝
本研究部分得到了GteX Program Japan（項目編號JPMJGX23B4）的支持。此外，還得到了JST SPRING（項目編號JPMJSP2135）對WH的支持。
