《Food Bioscience》：Construction of an antibiotic marker-free
Bacillus subtilis host via genome editing and secretion of a hyperthermostable β-galactosidase through signal peptides screening
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通過CRISPR-Cpf1技術構建安全的枯草芽孢桿菌分泌菌株BS801，篩選出SPdacB信號肽實現(xiàn)BgaS高效分泌，其乳糖水解率達92.64%，在90℃、pH7.0條件下仍保持高活性。
郭志豪|徐慧東|張赫|吳小哲|聶子深|李成杰|伊琳娜·德利多維奇|周靜文|夏宇
中國江南大學食品科學與技術學院食品科學與技術國家重點實驗室，無錫214122
摘要
β-半乳糖苷酶對于生產低乳糖牛奶至關重要。然而，大多數(shù)商用酶是嗜溫的，不適合高溫處理；而另一些酶的最佳pH值偏酸，與牛奶接近中性的pH值不兼容。來自Pyrococcus furiosus的耐熱β-半乳糖苷酶BgaS具有潛力，因為其最佳溫度為90°C，pH值為7.0。但由于其在非食品安全系統(tǒng)中的異源表達受到限制，且其分泌表達尚未得到充分研究。本研究通過CRISPR-Cpf1介導的無痕敲除技術，從高分泌效率的宿主WB800中敲除了3個抗生素抗性基因ble、hyg、bsr，構建了一種食品安全的Bacillus subtilis菌株BS801，并發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)后基因編輯效率有所提高。BgaS在BS801中實現(xiàn)了異源表達，通過篩選10種Sec途徑信號肽（SPs）優(yōu)化了其分泌表達。其中4種SPs有效促進了BgaS的分泌，其中蛋白DacB的信號肽（SPdacB）的分泌效率最高，細胞外酶活性達到0.42 U/mL。重組BgaS在80°C下孵育3小時后相對活性仍保持約80%。值得注意的是，該酶在90°C下4小時內可將原始牛奶中的乳糖水解至濃度低于0.5%（w/w），乳糖水解率達到了92.64%。這些結果表明，BS801菌株分泌的BgaS在乳制品工業(yè)中具有很好的應用潛力。
引言
β-半乳糖苷酶在乳制品工業(yè)中對于生產低乳糖牛奶起著關鍵作用。然而，大多數(shù)市售的β-半乳糖苷酶是嗜溫的，最佳反應溫度范圍為35至70°C（Gutierrez等人，2025年），因此無法承受高于70°C的高溫殺菌過程（Arsalan等人，2020年；Lin等人，2018年）。因此，必須在牛奶冷卻后添加這種酶進行反應。這一限制增加了工業(yè)生產過程中的微生物污染風險（Griep-Moyer等人，2022年）。另一種策略是使用適應低溫的乳糖酶在低溫下降解乳糖，但這需要分步驟進行巴氏殺菌和乳糖水解，導致工藝更加復雜。此外，許多商用β-半乳糖苷酶的最佳pH值偏酸（Shaikh等人，1999年；Zerva等人，2021年），與牛奶接近中性的pH值不兼容。因此，發(fā)現(xiàn)和研究具有中性最佳pH值的耐熱β-半乳糖苷酶在乳制品工業(yè)中具有重大價值。
先前的研究已經指出，來自Pyrococcus furiosus的β-半乳糖苷酶BgaS是一個有前景的候選酶，因為它具有較高的熱穩(wěn)定性。例如，BgaS的最佳反應溫度為90°C或更高，在80°C下孵育4小時后仍能保留超過80%的酶活性（Dong等人，2014年）。此外，其最佳pH值7.0與牛奶的pH值非常接近。然而，在以往的研究中，BgaS的異源表達主要在E. coli中進行（D?abrowski等人，2000年；Dong等人，2014年）。由于E. coli具有產生毒素的能力，這引發(fā)了食品安全問題，在食品工業(yè)中是不可接受的（Movahedpour等人，2022年）。另外，由于Pyrococcus furiosus的BgaS是一種胞內酶，關于其分泌表達的報道很少，進一步限制了其工業(yè)應用潛力。
為了利用BgaS的優(yōu)勢特性并克服上述限制，選擇一個具有強大蛋白質分泌能力的食品安全表達宿主至關重要。Bacillus subtilis是一種被廣泛認可的GRAS（Generally Recognized as Safe）表達宿主（Yang等人，2016年）。該物種及其衍生物具有增強的蛋白質分泌能力（Gu等人，2018年；Xiang等人，2020年），并且擁有多種分泌途徑和全面的信號肽系統(tǒng)，使其在蛋白質表達和分泌方面具有優(yōu)勢（Chen等人，2016年；Degering等人，2010年）。先前的研究表明，尤其是屬于B. subtilis Sec途徑的信號肽具有最高的分泌效率（Brockmeier等人，2006年；Duan & Luan，2023年）。例如，改良的高性能宿主菌株B. subtilis WB800表現(xiàn)出優(yōu)異的分泌能力（S.-C. Wu等人，2002年）。然而，在構建過程中引入了三個外源抗生素抗性基因，這對工業(yè)應用存在安全風險。隨著CRISPR基因編輯技術在B. subtilis中的應用，現(xiàn)在可以構建出無痕且食品安全的菌株用于工業(yè)用途（Y. Wu, Liu等人，2020年；Y. Wu, Chen等人，2020年）。
在這項工作中，選擇了來自P. furiosus的β-半乳糖苷酶BgaS在B. subtilis中進行分泌表達。基于B. subtilis WB800，使用CRISPR-Cpf1基因編輯系統(tǒng)無痕敲除了外源抗性基因，構建了一種食品安全的B. subtilis表達宿主BS801。隨后通過信號肽篩選研究了BgaS在BS801中的分泌表達，進一步降低了生產成本和潛在的安全風險。結果表明，這種食品安全菌株能夠有效分泌BgaS，乳糖水解數(shù)據表明其在乳制品加工中具有很高的應用潛力。
菌株、質粒和材料
本研究使用的質粒、菌株和引物列在表S1中。質粒pMA5-Lip和pMA5-MCS之前已在本實驗室構建并保存。Bacillus subtilis WB800菌株保存在本實驗室，其衍生菌株也在此研究中構建。質粒pXHD1.1及其用于BgaS異源表達和信號肽篩選的衍生質粒也是在本研究中構建的。質粒pHT-XCR6用于Cpf1蛋白表達
CRISPR-Cpf1輔助刪除三個抗性標記基因
為了驗證pHT-XCR6的陽性轉化子，從構建的重組菌株WB800(pHT-XCR6)中提取質粒并進行瓊脂糖凝膠電泳驗證，結果見圖S3。質粒pHT-XR6的大小接近理論值14,002 bp，表明質粒已成功導入細胞，重組菌株WB800(pHT-XCR6)已成功構建。
為了從WB800菌株中刪除抗性基因ble
結論
總之，通過CRISPR-Cpf1基因編輯系統(tǒng)，以B.subtilis WB800菌株為原始宿主，成功構建了一種具有高分泌能力和無抗性標記的新重組菌株BS801。BgaS在BS801中成功表達。重組BgaS的最佳反應溫度為90°C，最佳pH值為7.0。同時，該酶還具有良好的耐熱性，其相對活性幾乎保持不變
CRediT作者貢獻聲明
吳小哲：數(shù)據驗證、數(shù)據管理。張赫：實驗研究、數(shù)據分析。李成杰：寫作、審稿與編輯。聶子深：軟件開發(fā)、數(shù)據分析。周靜文：寫作、審稿與編輯。伊琳娜·德利多維奇：寫作、審稿與編輯。夏宇：寫作、審稿與編輯、資源協(xié)調、項目管理、資金爭取、概念構思。郭志豪：初稿撰寫、方法設計、實驗研究、數(shù)據分析、數(shù)據管理。徐慧東：初稿撰寫
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的競爭性財務利益或個人關系可能影響本文的研究結果。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的競爭性財務利益或個人關系可能影響本文的研究結果。
致謝
本工作得到了中國國家重點研發(fā)計劃（2021YFE0101800）的支持。
