《Plant Biotechnology Journal》：Enhancing CRISPR/Cas-Mediated Gene Knockout With Short Non-Homologous Oligonucleotides
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本研究報道了一種在萊茵衣藻中顯著提升CRISPR/Cas介導基因敲除（KO）效率的新策略。研究者通過將CRISPR-Cas基因編輯試劑與短鏈雙鏈非同源寡脫氧核苷酸（dsNHO）共遞送，可使基因敲除效率提升高達100倍。這一被命名為“非同源寡核苷酸增強”（NOE）的現象，主要通過細胞內的DNA雙鏈斷裂（DSB）感受器KU70/80（KU）異二聚體介導，與所用Cas核酸酶類型、靶點基因位點及藻株無關。該策略能擾亂細胞的DSB感知通路，將DNA修復平衡從典型的非同源末端連接（c-NHEJ）轉向更易出錯的微同源介導末端連接（MMEJ），從而產生更多導致基因功能喪失的插入/缺失（indel）突變。這項工作為在萊茵衣藻乃至更廣泛的生物體系中提高基因敲除效率提供了一種通用、高效且經濟的方法。
引言
萊茵衣藻是一種模型綠色微藻，在作為重組蛋白和高價值化學品生產的可持續生物工廠方面具有巨大工業潛力。高效的基因組編輯工具對于重新設計該生物體以用于合成生物學應用至關重要。CRISPR-Cas編輯技術已被用于萊茵衣藻的基因敲除、轉基因敲入和精確基因編輯。然而，CRISPR/Cas介導的基因敲除效率較低，這阻礙了途徑工程和功能基因組學研究。通常，CRISPR核糖核蛋白（RNP）復合物誘導的序列特異性DNA雙鏈斷裂主要由營養細胞中的典型非同源末端連接（c-NHEJ）DNA修復途徑修復，該途徑由KU70/80（KU）異二聚體復合物介導。但此過程易出錯，尤其是在重復DNA切割發生時，最終會在CRISPR靶位點產生短插入和缺失。在萊茵衣藻中，CRISPR-RNP誘導的敲除效率相對較低，范圍從10-6到5.2%。為提高敲除效率，通常可將CRISPR RNP與雙鏈DNA抗生素抗性盒共遞送，或使用具有同源臂的單鏈寡核苷酸，但這些方法存在選擇標記基因有限或整合序列大小受限等問題。本研究的初衷是探索將具有互補黏性末端的雙鏈非同源寡脫氧核苷酸精確敲入到Cas12a產生的交錯DSB中，但意外發現短鏈dsNHO的共遞送可大幅提升基因敲除效率。
結果
短鏈非同源寡核苷酸（dsNHO）能顯著增強萊茵衣藻中的基因敲除效率
研究者以萊茵衣藻cc-1883 cw15菌株的FKB12基因為靶點，該基因功能喪失會導致對雷帕霉素的抗性。當單獨遞送靶向FKB12的Cas12a RNP時，平均FKB12敲除效率僅為0.29%。然而，當將1 mM的、具有5‘黏性末端（5CO）的24-bp dsNHO與Cas12a RNP共遞送時，敲除效率增加了約150倍，達到44.5%。值得注意的是，單獨使用5CO未回收到任何雷帕霉素抗性菌落。對隨機選擇的抗性菌落中Cas12a切割位點周圍基因組區域進行測序分析，發現切割位點存在隨機缺失、微同源介導缺失以及dsNHO插入的混合情況，但未觀察到5CO的無疤痕精確敲入。
為了解敲除增強是否與dsNHO末端結構有關，研究者還設計了具有非互補3’黏端（3NO）和平末端（BE）的dsNHO。結果顯示，兩者均能像5CO一樣增強FKB12敲除效率。其中，平末端dsNHO在群體水平上被插入預期DSB的頻率顯著高于5CO和3NO，這表明盡管Cas12a產生交錯DSB，但萊茵衣藻的DNA修復機制更傾向于整合平末端dsNHO。此外，dsNHO內部序列的GC含量會影響其增強效果，GC含量較低的序列增強效果更佳，且這種增強作用依賴于dsNHO的濃度，在約50%的敲除效率時達到平臺期。
非同源寡核苷酸增強（NOE）現象的特征與機制探究
這種在哺乳動物細胞中也有報道的、因NHO將細胞轉向易錯修復而提升敲除效率的現象，被稱為“非同源寡核苷酸增強”（NOE）。研究者進一步探究了NHO的最佳長度和鏈類型。共遞送短單鏈NHO未能顯著提高敲除效率，而長單鏈NHO（如96 nt）則可以。對于雙鏈NHO，24 bp長度足以誘導NOE，且更長的dsNHO并未進一步增加效率。實驗表明，NOE依賴于雙鏈DNA結構，因為長單鏈NHO有更大潛力通過自退火形成雙鏈區域。不支持形成強二級結構的單鏈NHO（如48 nt胞嘧啶同聚物）無法引起同等程度的敲除增強，脫氧核苷酸（dNTP）或長鏈雙鏈DNA類似物（聚脫氧肌苷-脫氧胞苷酸）也未觀察到顯著的NOE效應。此外，在萊茵衣藻中，共遞送不同長度或二級結構的RNA未能像在人類細胞中那樣刺激NOE。
化學修飾實驗發現，在dsNHO的5‘和3’末端添加硫代磷酸酯（PT）修飾幾乎完全消除了NOE，而在dsNHO中間進行PT修飾則略微增強了敲除效率。這些觀察結果表明DNA末端的可及性可能很重要，暗示了DNA末端結合蛋白的參與。具體而言，外源dsNHO可能作為誘餌，將DNA修復蛋白（如KU異二聚體）從Cas12a切割位點轉移開，從而導致更易出錯的修復并提高敲除效率。KU異二聚體結合dsDNA所需的最小長度約為14-18 bp，這解釋了為何短于24 bp的dsNHO無效，以及NOE幅度依賴于所用dsNHO濃度。
DNA修復途徑在NOE中的關鍵作用
為了驗證上述假設，研究者通過敲入aphVIII盒產生了ku70、ku80、mre11和polq突變體。當單獨遞送Cas12a RNP時，在ku突變體中觀察到比野生型高約200倍的敲除效率，而在polq1和mre11突變體中敲除效率很低。在kupolq雙突變體中，敲除效率的增加被消除。這強烈表明c-NHEJ是參與Cas12a介導DSB修復的主要途徑，在其缺失時會發生易錯的MMEJ介導修復。
當dsNHO與Cas12a RNP共遞送時，在所有菌株中均觀察到敲除效率的顯著增加。通過計算相對于各自僅用Cas12a處理的敲除效率變化倍數，發現在野生型、polq1和mre11突變體中觀察到200至500倍的變化，而在ku和kupolq突變體中，相對于野生型，敲除增強的倍數變化顯著降低。這強烈表明KU異二聚體是NOE所必需的。對回收細胞群體的擴增子測序分析顯示，在僅用Cas12a轉染的ku突變體中，缺失率顯著增加，這與KU缺失允許易錯MMEJ修復發生的觀點一致。當共遞送dsNHO時，所有菌株的插入和缺失合并頻率均增加，但ku突變體中的插入頻率顯著降低，表明KU異二聚體是萊茵衣藻中dsNHO插入DSB的主要因素。
NOE的普適性驗證
研究發現，使用Cas9 RNP也能觀察到NOE現象。然而，與Cas12a相比，Cas9產生的敲除中超過一半涉及dsNHO在DSB處的串聯插入，而Cas12a僅約15%。這表明Cas12a和Cas9的結合動力學或切割產物釋放的差異可能影響DSB處的DNA修復結果。Cas9產生的小插入缺失（1-2 bp）在Cas12a RNP中未觀察到，而Cas12a則產生4-15 bp的MMEJ介導缺失。這表明Cas12a介導的交錯DSB可能促進末端切除，從而增加MMEJ修復相對于c-NHEJ的頻率。但無論如何，添加dsNHO都會增加靶向DSB處的易錯修復。
NOE現象在其他萊茵衣藻基因位點（如葉綠體定位蛋白基因FTSY和SRP43）和其他無細胞壁藻株（cc-3491、cc-4533和UVM4）中也得到證實。共遞送dsNHO使得原本效率極低（<0.04%）的敲除能夠被檢測到，并且在不同藻株中均能顯著增強基因敲除效率，盡管增強程度因菌株而異，表明不同菌株可能因DNA修復途徑效率不同而對外源DNA具有不同的“敏感性”。
討論
本研究表明，長度至少為24 bp的dsNHO與Cas12a或Cas9 RNP共遞送時，可將基因敲除效率提升高達兩個數量級，而能夠形成DNA二級結構的單鏈NHO也能產生此效果。這與人類細胞中的觀察存在定性和定量差異，可能歸因于DSB修復相關基因的結構和/或功能差異。研究者提出的“誘餌”模型認為，dsNHO將DNA修復蛋白（主要是KU異二聚體）從CRISPR-Cas誘導的DSB處隔離，從而將DNA修復從無誤修復轉向易錯途徑，進而增加CRISPR切割位點的插入缺失頻率。高濃度的dsNHO可與大多數可用的KU異二聚體相互作用并最終使其飽和，將其從CRISPR-Cas誘導的DSB轉移開，這些被釋放的DSB隨后將主要由易錯的MMEJ途徑修復。然而，在ku突變體中敲除效率仍能提高三倍，表明其他dsDNA結合蛋白也可能對NOE有貢獻。
“誘餌”效應不可能是增強敲除效率的唯一現象，因為也觀察到dsNHO插入靶向DSB的增加。這可以通過dsNHO在靶向DSB附近的鄰近性及其隨后通過c-NHEJ途徑的整合來解釋，從而導致移碼突變并提升敲除效率。研究中使用的是非磷酸化寡核苷酸，24 bp的dsNHO足以誘導NOE，且敲除效率不隨長度增加至96 nt而進一步提高，這表明更長的dsDNA也可能在萊茵衣藻中有效觸發NOE。
結論與展望
在共轉染dsNHO與CRISPR-Cas RNP的所有實驗中，均觀察到基因敲除效率相比單獨使用RNP有顯著提升（從5倍到兩個數量級）。這些數據清楚地表明，添加dsNHO可以增強甚至挽救低效的CRISPR RNP，且與所使用的核酸酶或靶點基因位點無關。位點特異性因素，如染色質可及性、gRNA有效性、局部DNA修復動力學和細胞周期，都可能造成敲除提升效率的差異。任何使用外源DNA的基因編輯技術都可能導致脫靶整合，從而在基因組其他位置產生不必要的突變。為規避此問題，建議生成三個或更多獨立的基因敲除株系以驗證后續表型。鑒于c-NHEJ途徑是基因敲除的主要參與者，未來尋找萊茵衣藻KU異二聚體的高效抑制劑至關重要。這種抑制劑可以瞬時抑制c-NHEJ，從而提升該生物體中的基因編輯效率。
