《Biotechnology Progress》：Sequential, chromosome-specific glutamine synthetase double knockout with Cas-CLOVER establishes enhanced CHO platforms for cell line development
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本文探討了應用新型高保真基因編輯系統(tǒng)Cas-CLOVER，在懸浮適應型CHO-K1細胞中順序敲除位于染色體5（GS5）和染色體1（GS1）的內(nèi)源性谷氨酰胺合成酶（GS）基因，成功構建了雙敲除（GS-DKO）宿主細胞平臺（命名為CleanCut GS）。研究通過與CRISPR/Cas9對比，驗證了Cas-CLOVER在GS5與GS1位點更高的編輯效率（84% vs. 57.4%；74% vs. 62%）及在40個預測脫靶位點均未檢測到脫靶突變。該平臺結合專有的Harbor-IN轉座子系統(tǒng)穩(wěn)定表達曲妥珠單抗后，在24深孔板補料分批培養(yǎng)14天后，細胞特異性生產(chǎn)力（Qp）超過100 pg/細胞/天，抗體滴度大于5 g/L，且產(chǎn)量穩(wěn)定性可維持超過60代。本研究為生物制藥工業(yè)提供了具有高生產(chǎn)效率、低脫靶風險的CHO細胞系開發(fā)新工具和新平臺。
1. 引言
中國倉鼠卵巢（CHO）細胞因其強大的懸浮生長能力、適應化學成分明確培養(yǎng)基、能夠進行與人相容的糖基化以及在補料分批培養(yǎng)中實現(xiàn)高產(chǎn)，成為重組蛋白特別是治療性抗體生產(chǎn)的主要表達系統(tǒng)。高效的細胞系開發(fā)（CLD）依賴于早期篩選高產(chǎn)CHO克隆的能力。谷氨酰胺合成酶（GS）選擇系統(tǒng)是主流策略之一，其通過敲除內(nèi)源性GS基因可增強選擇嚴格性。研究表明，CHO細胞中主要GS基因位于5號染色體（GS5），而一個近期發(fā)現(xiàn)的假基因位于1號染色體（GS1）。為獲得更徹底的代謝選擇壓力，需要同時敲除這兩個位點。傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在CHO細胞中脫靶編輯率較高（>10%），且有約7%的染色體重排風險，限制了其在工業(yè)CLD中的廣泛應用。Cas-CLOVER是一種新興的二聚體RNA引導核酸酶系統(tǒng)，具有高保真性且脫靶活性顯著降低，為開發(fā)高產(chǎn)CHO宿主平臺提供了有潛力的新工具。
2. 材料與方法
研究設計了靶向GS5外顯子6和GS1外顯子1（與GS5外顯子4/5同源）的成對向?qū)NA（gRNA）。使用Neon?電穿孔系統(tǒng)比較了Cas-CLOVER和Cas9在GS5和GS1位點的編輯效率。為構建宿主平臺，將貼壁CHO-K1細胞逐步適應至無血清懸浮培養(yǎng)，并使用Cas-CLOVER通過核轉染依次敲除GS5（生成GS5單敲除細胞系，GS5-SKO）和GS1（生成GS雙敲除細胞系，GS-DKO）。通過單細胞克隆（SCC）篩選和Sanger測序驗證基因型。利用Harbor-IN轉座子系統(tǒng)（一種專有的轉座酶），將包含曲妥珠單抗輕重鏈和GS轉基因的表達框穩(wěn)定整合到細胞基因組中。通過24深孔板補料分批培養(yǎng)評估抗體滴度和細胞特異性生產(chǎn)力（Qp），并使用全基因組測序（WGS）分析脫靶效應。
3. 結果
3.1 Cas-CLOVER在GS編輯中展現(xiàn)出比Cas9更高的效率
在GS5位點，Cas-CLOVER實現(xiàn)了84%的編輯效率，而Cas9使用左、右單個gRNA分別為57.4%和30.4%。在GS1位點，Cas-CLOVER達到74%，Cas9則分別為62%和54.4%。這表明Cas-CLOVER在CHO-K1細胞中對GS位點的編輯效率顯著優(yōu)于Cas9。
3.2 Cas-CLOVER成功構建GS5單敲除與GS雙敲除CHO細胞系
研究成功構建了GS5-SKO細胞系，并從篩選出的克隆中選擇了7G2克隆進行后續(xù)實驗。隨后，在7G2基礎上敲除GS1，獲得了GS-DKO細胞系，最終選擇F8克隆并命名為CleanCut GS平臺。谷氨酰胺敏感性實驗證實，GS5-SKO克隆在第9天完全喪失增殖能力，而GS-DKO克隆在第6天就已完全喪失，證明雙敲除能實現(xiàn)更嚴格、更快速的代謝選擇。
3.3 CleanCut GS細胞池及克隆支持高滴度曲妥珠單抗生產(chǎn)
將GS5-SKO細胞池和CleanCut GS細胞池分別用Harbor-IN系統(tǒng)表達曲妥珠單抗。14天培養(yǎng)后，GS5-SKO池的抗體滴度為1.65 g/L，Qp為55.2 pg/細胞/天。而CleanCut GS池的滴度達到4.21 g/L，Qp為83.9 pg/細胞/天，產(chǎn)量顯著提升。從CleanCut GS池中篩選出的兩個高產(chǎn)克隆（5G2和31H3）性能更優(yōu)，滴度分別達到5.6 g/L和5.3 g/L，Qp均超過100 pg/細胞/天，展現(xiàn)了卓越的生產(chǎn)能力。
3.4 CleanCut GS-TZ細胞池與克隆的抗體生產(chǎn)在60代內(nèi)保持穩(wěn)定
對CleanCut GS-TZ細胞池和5G2-TZ克隆進行長達60代的傳代穩(wěn)定性分析。結果顯示，兩者的抗體滴度和Qp在傳代過程中保持基本一致。數(shù)字PCR（dPCR）檢測顯示，Harbor-IN系統(tǒng)整合的曲妥珠單抗轉基因拷貝數(shù)在60代內(nèi)也保持穩(wěn)定，證實了該平臺具有長期穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。
3.5 Cas-CLOVER編輯在GS位點未檢測到脫靶效應
對CHO-K1野生型、GS5-SKO克隆（7G2）和CleanCut GS克隆（F8）進行全基因組測序，并對CRISPOR工具預測的40個最可能的脫靶位點進行分析。在所有分析的脫靶位點中，均未檢測到由Cas-CLOVER編輯導致的脫靶突變。僅在靶向位點發(fā)現(xiàn)了預期的缺失突變，證明了Cas-CLOVER系統(tǒng)的高特異性。
4. 討論
本研究首次評估了Cas-CLOVER在CHO細胞中進行GS雙敲除的效率和特異性，并將其與CRISPR/Cas9進行了比較。Cas-CLOVER憑借其二聚體設計，在編輯高度同源的GS1和GS5位點時表現(xiàn)出優(yōu)異的精確性，有效避免了脫靶。所建立的CleanCut GS CHO細胞平臺，結合了高效的GS雙敲除選擇優(yōu)勢和Harbor-IN轉座子系統(tǒng)的穩(wěn)定整合能力，能夠快速生成高產(chǎn)、穩(wěn)定的抗體生產(chǎn)細胞池或克隆。與既往僅使用CRISPR/Cpf1等工具的研究相比，本研究構建的平臺在抗體滴度和細胞特異性生產(chǎn)力方面均取得了顯著提升。這一集成平臺為生物制藥工業(yè)提供了一個加速細胞系開發(fā)進程、降低生產(chǎn)成本且不受復雜知識產(chǎn)權限制的實用解決方案。
5. 結論
綜上所述，Cas-CLOVER是一種適用于工業(yè)CLD的高效、高保真基因編輯工具。利用它構建的CleanCut GS CHO宿主細胞平臺，與Harbor-IN轉座子系統(tǒng)相結合，能夠快速開發(fā)出高產(chǎn)、穩(wěn)定的生物制品生產(chǎn)細胞系。該平臺的成功建立，為下一代生物制品的低成本、高效率制造鋪平了道路。
