《Advanced Science》：Glucuronolactone Promotes Mucin Sulfation to Alleviate Deoxynivalenol-Induced Intestinal Injury via Microbiota-Dependent and -Independent AHR Activation
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本研究揭示了葡萄糖醛酸內(nèi)酯通過促進(jìn)腸道黏蛋白硫酸化來緩解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）誘導(dǎo)的腸道損傷的新機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，一方面GLU通過增加益生菌解淀粉乳桿菌的豐度和管腔吲哚-3-乙酸（IAA）水平激活芳烴受體（AHR）信號通路，另一方面GLU自身也能直接獨(dú)立于微生物群激活A(yù)HR。激活的AHR轉(zhuǎn)錄上調(diào)了硫酸基轉(zhuǎn)移酶GAL3ST3的表達(dá)，進(jìn)而驅(qū)動了關(guān)鍵的黏蛋白硫酸化過程。這項(xiàng)研究為對抗DON污染的腸道毒性提供了一種有前景的營養(yǎng)干預(yù)策略。
1 引言
脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）是一種由鐮刀菌屬產(chǎn)生的普遍存在的單端孢霉烯族霉菌毒素，是全球范圍內(nèi)對人類和牲畜腸道健康的主要威脅。其在小腸的暴露和吸收過程中會誘發(fā)嚴(yán)重的腸道損傷和免疫功能障礙。維持腸道杯狀細(xì)胞穩(wěn)態(tài)是緩解DON誘導(dǎo)的腸道損傷的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。葡萄糖醛酸內(nèi)酯是一種來源于葡萄糖的天然代謝物，具有免疫調(diào)節(jié)特性，但其能否以及如何緩解DON誘導(dǎo)的腸道損傷尚不清楚。
本研究采用多模型方法，包括仔豬和小鼠體內(nèi)模型、豬腸道類器官和豬腸道上皮細(xì)胞系，探究了GLU對DON誘導(dǎo)腸道損傷的保護(hù)作用。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組-微生物組-代謝組學(xué)分析，揭示了GLU通過微生物依賴和非依賴途徑，激活A(yù)HR信號通路促進(jìn)黏蛋白硫酸化，從而維持腸道屏障穩(wěn)態(tài)的保護(hù)機(jī)制。
2 結(jié)果
2.1 GLU減輕DON誘導(dǎo)的腸道損傷和炎癥
在仔豬模型中，與CON組相比，DON組仔豬回腸出現(xiàn)了嚴(yán)重的病理變化，包括黏膜下水腫、上皮層損傷和固有層炎性細(xì)胞浸潤，而補(bǔ)充GLU有效地減輕了這些病理變化。DON挑戰(zhàn)提高了血清脂多糖（LPS）和腸道脂肪酸結(jié)合蛋白（iFABP）水平，并下調(diào)了緊密連接蛋白ZO-1和Claudin-1的表達(dá)，而GLU顯著降低了血清LPS水平，并增強(qiáng)了它們的表達(dá)。DON誘導(dǎo)了促炎因子白介素-8（IL-8）的表達(dá)并抑制了抗炎因子IL-10的表達(dá)，而GLU降低了TNF-α和IL-8的表達(dá)并提高了IL-10的表達(dá)。這些結(jié)果表明GLU可以減輕DON誘導(dǎo)的腸道損傷和炎癥。
2.2 GLU通過促進(jìn)黏蛋白硫酸化來緩解DON誘導(dǎo)的腸道損傷
轉(zhuǎn)錄組分析表明，GLU在穩(wěn)態(tài)和DON挑戰(zhàn)下均引發(fā)了基因表達(dá)的顯著改變，差異表達(dá)基因（DEG）主要富集在與杯狀細(xì)胞來源的黏蛋白相關(guān)的通路中。組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，DON降低了回腸絨毛中杯狀細(xì)胞數(shù)量，而GLU處理則提高了其數(shù)量。此外，GLU處理還顯著提高了杯狀細(xì)胞標(biāo)志物MUC2和TFF3的表達(dá)。
值得注意的是，在腸道上皮轉(zhuǎn)錄組的KEGG通路分析中，GLU誘導(dǎo)的DEGs還富集在與硫相關(guān)的通路中，這提示了杯狀細(xì)胞來源的硫酸化黏蛋白。高碘酸雪夫/阿利新藍(lán)（HID/AB）染色和Maackia Amurensis凝集素II（MALII）染色顯示，DON降低了回腸上皮中的硫酸化黏蛋白豐度，而GLU則顯著增加了其豐度。相關(guān)性分析進(jìn)一步表明，硫酸化黏蛋白的豐度與回腸上皮損傷評分和炎癥評分呈負(fù)相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明，GLU可以通過促進(jìn)黏蛋白硫酸化來緩解DON誘導(dǎo)的腸道損傷。
2.3 GLU相關(guān)的腸道微生物群支持黏蛋白硫酸化并減輕DON誘導(dǎo)的腸道損傷
考慮到杯狀細(xì)胞可以通過分泌黏蛋白調(diào)節(jié)腸道微生物群，研究調(diào)查了GLU和/或DON處理后仔豬回腸微生物群的穩(wěn)態(tài)。結(jié)果顯示，DON挑戰(zhàn)導(dǎo)致回腸中細(xì)菌定植顯著增加，而補(bǔ)充GLU則減少了細(xì)菌定植。主坐標(biāo)分析表明各組間細(xì)菌譜存在顯著差異，而α多樣性指數(shù)無顯著差異。線性判別分析效應(yīng)大小分析發(fā)現(xiàn)，益生菌如解淀粉乳桿菌和羅伊氏乳桿菌在GLU處理組中富集。通過回腸微生物群移植實(shí)驗(yàn)和共居實(shí)驗(yàn)，研究證實(shí)了GLU相關(guān)的腸道微生物群能夠促進(jìn)黏蛋白硫酸化，并且GLU相關(guān)的微生物群可以減輕DON誘導(dǎo)的腸道損傷。
2.4 解淀粉乳桿菌促進(jìn)IAA產(chǎn)生以支持黏蛋白硫酸化
為了探究GLU相關(guān)微生物群中影響?zhàn)さ鞍琢蛩峄臐撛诖x物，對仔豬回腸內(nèi)容物進(jìn)行了代謝組學(xué)分析。分析發(fā)現(xiàn)，GLU和/或DON處理導(dǎo)致回腸代謝物譜發(fā)生顯著改變，差異代謝物在與色氨酸相關(guān)的通路中富集。在色氨酸代謝產(chǎn)物中，GLU補(bǔ)充在穩(wěn)態(tài)下顯著增加了吲哚和IAA的豐度，在DON挑戰(zhàn)下增加了色氨酸和IAA的豐度。研究發(fā)現(xiàn)，在共居實(shí)驗(yàn)中，GLU處理上調(diào)了回腸內(nèi)容物中的IAA水平，并且將CON小鼠與GLU小鼠共居也提高了CON小鼠的IAA水平。進(jìn)一步的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，IAA補(bǔ)充能顯著提高小鼠回腸和腸道類器官中的硫酸化黏蛋白豐度。
分析發(fā)現(xiàn)，DON攻擊導(dǎo)致解淀粉乳桿菌豐度有下降趨勢，而GLU在穩(wěn)態(tài)和DON條件下均能增加羅伊氏乳桿菌和解淀粉乳桿菌的豐度。值得注意的是，相關(guān)性分析顯示IAA與解淀粉乳桿菌而非羅伊氏乳桿菌呈顯著正相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)證明，添加色氨酸時(shí)，解淀粉乳桿菌顯著提高了培養(yǎng)基中的IAA水平。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，給抗生素預(yù)處理的灌胃解淀粉乳桿菌可提高回腸IAA水平并增加硫酸化黏蛋白豐度。這些發(fā)現(xiàn)提示，解淀粉乳桿菌能夠促進(jìn)IAA的產(chǎn)生以支持黏蛋白硫酸化。
2.5 GLU以微生物群非依賴的方式促進(jìn)黏蛋白硫酸化并減輕DON誘導(dǎo)的腸道損傷
鑒于GLU的免疫調(diào)節(jié)特性，研究推測GLU本身也可能改善黏蛋白硫酸化和DON誘導(dǎo)的腸道損傷。使用抗生素處理清除腸道微生物群后，盡管管腔IAA水平未因GLU而改變，但GLU給藥仍能上調(diào)回腸中的硫酸化黏蛋白豐度。此外，在無菌的豬腸道類器官中進(jìn)行GLU處理的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，GLU能夠促進(jìn)黏蛋白硫酸化。研究還發(fā)現(xiàn)，在沒有腸道微生物群的情況下，GLU仍能減輕DON誘導(dǎo)的腸道損傷，改善腸道屏障功能和炎癥狀態(tài)。這些發(fā)現(xiàn)表明，GLU可以獨(dú)立于腸道微生物群而促進(jìn)黏蛋白硫酸化并減輕DON誘導(dǎo)的腸道損傷。
2.6 GLU通過激活A(yù)HR促進(jìn)黏蛋白硫酸化
研究表明，AHR信號在黏蛋白硫酸化中起重要作用。免疫染色和qPCR分析顯示，DON挑戰(zhàn)減弱了AHR及其靶基因CYP1A1和CYP1B1的表達(dá)，而補(bǔ)充GLU恢復(fù)了它們的表達(dá)。在GLU相關(guān)LA和IAA補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)中，也觀察到AHR信號活性的增強(qiáng)。對DON和/或GLU處理的豬腸道上皮轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)重新分析發(fā)現(xiàn)，DON降低了AHR、CYP1A1和CYP1B1的基因表達(dá)，而GLU處理挽救了AHR和CYP1A1的表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡分析也證明GLU在DON挑戰(zhàn)后恢復(fù)了AHR信號活性。分子對接和分子動力學(xué)模擬分析顯示，GLU可以作為豬AHR的配體與之結(jié)合。
利用AHR敲除小鼠和AHR拮抗劑CH-223191，研究發(fā)現(xiàn)GLU無法再提高CYP1A1和CYP1B1的mRNA表達(dá)，其促進(jìn)黏蛋白硫酸化的作用也被消除。在AHR被抑制的情況下，GLU對DON誘導(dǎo)的腸道損傷和炎癥的保護(hù)作用也消失了。這表明GLU通過激活A(yù)HR信號來促進(jìn)黏蛋白硫酸化。
2.7 GLU通過AHR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強(qiáng)硫酸基轉(zhuǎn)移酶GAL3ST3的表達(dá)
為了探究GLU介導(dǎo)的AHR激活促進(jìn)黏蛋白硫酸化的分子機(jī)制，研究分析了與硫酸化相關(guān)的各種酶的基因表達(dá)。值得注意的是，GLU處理誘導(dǎo)了許多硫酸化相關(guān)酶的表達(dá)，而DON挑戰(zhàn)抑制了它們的表達(dá)。在這些酶中，只有硫酸基轉(zhuǎn)移酶GAL3ST3的表達(dá)在穩(wěn)態(tài)和DON挑戰(zhàn)下均被GLU上調(diào)。蛋白質(zhì)印跡分析也顯示，GLU給藥有效地恢復(fù)了DON挑戰(zhàn)下的GAL3ST3蛋白表達(dá)。相關(guān)性分析顯示，硫酸化黏蛋白豐度與豬回腸中GAL3ST3的相對表達(dá)呈正相關(guān)。
研究發(fā)現(xiàn)，使用AHR拮抗劑CH-223191可以成功抑制體外AHR信號活性，并且GLU對GAL3ST3表達(dá)的促進(jìn)作用被CH-223191逆轉(zhuǎn)，這表明AHR信號對于GLU介導(dǎo)的GAL3ST3表達(dá)至關(guān)重要。在AHR敲除小鼠中，GAL3ST3mRNA表達(dá)顯著降低。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和染色質(zhì)切割與運(yùn)行定量PCR分析證實(shí)，AHR可以直接結(jié)合到豬GAL3ST3基因的啟動子上，并且GLU給藥有效增強(qiáng)了這種結(jié)合。利用GAL3ST3敲除小鼠，研究證實(shí)GAL3ST3對于GLU介導(dǎo)的黏蛋白硫酸化和腸道保護(hù)至關(guān)重要。
3 討論
本研究系統(tǒng)性地探索了GLU通過微生物依賴和非依賴途徑減輕DON誘導(dǎo)腸道損傷的機(jī)制。一方面，GLU通過增加解淀粉乳桿菌的豐度和管腔IAA水平來激活A(yù)HR信號通路；另一方面，GLU本身可以直接獨(dú)立于微生物群和IAA提高AHR信號活性。GLU對AHR的激活轉(zhuǎn)錄促進(jìn)了硫酸基轉(zhuǎn)移酶GAL3ST3的表達(dá)，從而驅(qū)動了黏蛋白硫酸化，最終緩解了DON誘導(dǎo)的腸道損傷。本研究結(jié)果確定了GLU作為一種有前途的營養(yǎng)干預(yù)或治療劑，以對抗DON污染對腸道健康的危害，并強(qiáng)調(diào)了AHR驅(qū)動的黏蛋白硫酸化是宿主防御DON誘導(dǎo)腸道損傷的關(guān)鍵機(jī)制。
