《Advanced Science》：Deep Volumetric Super-Resolution Imaging in Thick Biological Specimens With Sparse Scanning SIM
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這篇論文報告了一種用于厚生物樣本深層成像的稀疏掃描結構光照明顯微術(SS-SIM)。該方法將快速激光束掃描與像素尋址的強度調制及sCMOS檢測相結合，能實現約150 nm的空間分辨率，在整個可用成像深度（受限于物鏡工作距離，可達300/600 μm）內，其橫向和軸向分辨率分別比寬場顯微鏡提高了1.6/1.7倍。SS-SIM兼具單光子(1PE)與雙光子(2PE)激發能力，其簡單、魯棒和高性能的特點，為厚組織、類器官和小型生物體等復雜生物環境下的高對比度三維可視化提供了實用方案。
引言
高分辨率熒光顯微成像對于探索生物結構、動力學和功能至關重要，但傳統遠場成像受阿貝衍射極限限制。結構光照明顯微術(SIM)作為一種快速超分辨率成像技術，因其適用性廣和光毒性低而受到青睞，但其對散射的敏感性限制了在厚樣本中的體積成像應用。為解決這一挑戰，本文提出了一種新型的稀疏掃描結構光照明顯微術(SS-SIM)。
SS-SIM顯微鏡概述與結構光照
SS-SIM系統基于一個自建熒光顯微鏡平臺，集成了水浸物鏡、脈沖激光器（用于1PE和2PE）和寬場sCMOS相機。其核心原理是通過快速共振掃描鏡(RM)和電流計反射鏡(GM)對激光焦點進行掃描，并同步調制激光強度，從而在單個相機幀的積分時間內生成焦平面上的任意二維激發圖案。
與使用密集干涉條紋的傳統SIM不同，SS-SIM采用條紋間距為2.4 μm的稀疏條紋圖案。模擬和實驗均表明，較大的條紋間距能有效保持高條紋對比度，從而在更長的軸向范圍內維持高質量的成像。這種設計賦予了SS-SIM優于傳統SIM的八倍更短的軸向擴展和光學切片能力，這是其實現深層成像的關鍵。
超分辨率圖像采集與重建
SS-SIM的成像流程包括采集一組具有不同相移和方向的原始圖像。為追求快速成像，本文采用了正交照明圖案方案，在每個橫向維度上采集12幅相移條紋圖案。因此，一次SS-SIM重建總共需要采集24幅原始圖像，耗時僅0.65秒，比傳統的單點掃描SIM快一個數量級。
稀疏條紋圖案的周期剖面包含五個顯著高于噪聲的空間諧波。通過類似于非線性SIM的圖像重建算法，可以將這些高頻信息移入系統的衍射極限通帶，最終實現相對于標準寬場(WF)成像約1.6倍的空間分辨率提升。對固定在蓋玻片上的40納米熒光微球的成像實驗證實，SS-SIM的橫向分辨率（FWHM）達到154±12納米，而WF為246±12納米，分辨率提升因子恰好為1.6。
仿體樣本的超分辨體積成像
為了驗證SS-SIM的深層成像能力，研究團隊將熒光微球嵌入瓊脂糖凝膠中制備了三維仿體樣本。使用長工作距離物鏡，在軸向600 μm的深度范圍內以400 nm為步長采集圖像。
結果顯示，在整個軸向范圍內，SS-SIM的圖像清晰度顯著優于WF和線共聚焦成像。定量分析表明，SS-SIM相對于WF和線共聚焦，平均分別實現了1.5倍和1.3倍的橫向分辨率增強、1.7倍和1.4倍的軸向分辨率增強，并且信背比(SBR)分別提升了8.6倍和3.6倍。這充分證明單光子SS-SIM能夠在高達600 μm的軸向范圍內實現深層三維超分辨率成像。
COS-7細胞中亞細胞器成像
接下來，研究應用SS-SIM對培養的COS-7細胞（猿猴成纖維樣細胞系）的亞細胞結構進行成像。通過免疫標記線粒體外膜蛋白Tom20和微管蛋白α-tubulin，分別對線粒體和微管進行成像。
SS-SIM圖像在線粒體和微管的成像中均展現出比WF更高的分辨率和圖像對比度。例如，在微管成像中，SS-SIM模式的FWHM為171±6納米，而WF為275±14納米，實現了1.6倍的分辨率提升，且信背比提高了五倍。SS-SIM能夠清晰分辨WF圖像中無法區分的三條緊密排列的微管，進一步證明了其卓越的解析能力。
斑馬魚幼體的體積成像
斑馬魚幼體被用作厚組織樣本，以測試SS-SIM的深層組織成像能力。使用STAR RED-鬼筆環肽標記肌動蛋白絲(F-actin)，對斑馬魚尾部肌肉和眼部虹膜區域進行三維成像。
在尾部肌肉區域，WF圖像中肌纖維分辨率差且背景噪聲高，而SS-SIM圖像背景幾乎被完全抑制，能夠清晰顯示肌纖維的橫紋結構。在眼部，SS-SIM成功揭示了負責瞳孔擴張的虹膜放射狀瞳孔開大肌纖維的詳細結構。與標準共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)相比，SS-SIM在達到相似穿透深度和信背比的同時，獲得了1.6倍的橫向分辨率提升，且圖像采集速度快了67倍。
雙光子熒光激發的體積成像
雙光子激發(2PE)顯微術因其固有的光學切片能力、減少的光漂白和更深的組織穿透深度，成為深層組織成像的優異模態。研究團隊在SS-SIM系統中集成了920納米飛秒脈沖激光作為2PE激發源。
對瓊脂糖凝膠中熒光微球的成像實驗表明，2PE SS-SIM在整個深度范圍內均提供顯著優于WF和線共聚焦的圖像質量，平均分別實現1.5倍和1.2倍的橫向分辨率增強、1.8倍和1.2倍的軸向分辨率增強，以及4.3倍和7.5倍的信背比提升。此外，研究還將2PE SS-SIM應用于表達綠色熒光蛋白(GFP)家族熒光蛋白的轉基因動物組織樣本，包括斑馬魚運動神經元、小鼠腎臟和腦切片。在所有樣本中，SS-SIM圖像均顯示出優于線共聚焦圖像的信背比和空間分辨率。對表達Thy1-EGFP融合蛋白的小鼠腦組織（經透明化處理）的成像，成功清晰地顯示了神經元網絡中的細胞體、軸突和樹突等精細結構。
討論
本研究表明，SS-SIM能夠在厚樣本深處實現高對比度和高空間分辨率（橫向和軸向）的熒光成像。其光學設計概念簡潔，結合了快速聚焦激光束掃描、像素尋址強度調制和同步sCMOS檢測。得益于這種簡單性，SS-SIM可以僅通過適度修改即可集成到現有的共聚焦顯微鏡平臺中。
目前SS-SIM的實現使用了包含五個諧波的周期性條紋圖案，實現了相對于衍射極限約1.6倍橫向和1.7倍軸向的分辨率提升。使用高度聚焦的光進行結構照明賦予了該方法優異的光學切片能力。未來的改進方向包括：使用二維晶格圖案（如正交或三角晶格）替代一維條紋，以減少原始圖像數量，從而加速數據采集；采用隨深度增加而增大的可變條紋周期方案，以平衡成像速度與信噪比；集成自適應光學以補償系統和樣本引起的像差，進一步提升在厚且強散射樣本中的成像性能。
與線掃描SIM、多線正交掃描時間聚焦(mosTF)顯微術、雙光子即時SIM(2P ISIM)和多共聚焦ISM(MC-ISM)等其他高速深層組織成像模態相比，SS-SIM因其采用緊聚焦照明生成的稀疏條紋圖案而在成像深度上表現優異，其高成像速度則主要源于與激光強度調制同步的快速共振光束掃描。
結論
總而言之，SS-SIM為使用單光子或雙光子激發的深層組織熒光成像提供了顯著優勢。憑借其概念上的簡潔性，SS-SIM有望成為對組織、類器官和模式生物（包括活體樣本）進行高分辨率成像的通用工具。
