骨關節炎(OA)是一種以關節軟骨進行性退變、滑膜炎癥和軟骨下骨改變為特征的慢性退行性關節疾病，是全球范圍內致殘的主要原因之一。其病理過程涉及機械應力、炎癥介質和遺傳易感性等多種因素的復雜相互作用，可觸發包括鐵死亡、線粒體功能障礙、活性氧(ROS)過量產生、促炎細胞因子和基質降解酶過度表達以及衰老相關分泌表型(SASP)因子分泌增加在內的多種病理途徑。Asporin(ASPN)是細胞外基質(ECM)富含亮氨酸重復序列蛋白家族的成員，最初在人類軟骨組織中發現。研究表明，ASPN通過與轉化生長因子-β(TGF-β)和骨形態發生蛋白-2(BMP-2)等生長因子相互作用，形成負向調節軟骨形成、增加OA易感性的反饋環。此外，ASPN的表達水平與OA嚴重程度呈正相關，加速軟骨退變并加劇炎癥，凸顯了其作為OA治療潛在靶點的重要性。

基因編輯技術，特別是CRISPR-Cas9，為疾病治療帶來了革命性前景。然而，其體內安全高效的遞送仍是重大挑戰。病毒載體存在免疫原性等問題，而非病毒納米載體，尤其是工程化外泌體，因其優異的生物相容性、低免疫原性和組織靶向能力而備受關注。本研究旨在開發一種軟骨細胞靶向的工程化外泌體，用于遞送靶向ASPN基因的CRISPR/Cas9系統，以實現對OA的精準基因治療。

通過對GEO數據庫(GSE114007, GSE169077, GSE207881)的生物信息學分析，研究者篩選出OA相關的差異表達基因(DEGs)。維恩圖分析顯示，在三個數據集中共同上調的DEGs有20個，其中ASPN是OA組與正常組之間表達差異最顯著的基因，在OA軟骨中顯著上調。對不同程度OA小鼠模型的組織學分析也證實，隨著OA嚴重程度增加，關節面粗糙、軟骨侵蝕加劇，OARSI評分升高，同時ASPN的陽性表達也隨之增強。蛋白質印跡(WB)分析進一步顯示，從不同嚴重程度OA模型分離的軟骨細胞中，ASPN蛋白表達水平呈進行性上升，且與OA嚴重程度呈強正相關。這些結果共同證實了ASPN在OA發病機制中的關鍵作用，是疾病進展的潛在指標。

鑒于ASPN在OA中的重要作用，研究者構建了靶向ASPN基因的CRISPR-Cas9基因編輯平臺(ASPN-Cas9)。為了實現對OA軟骨細胞的靶向遞送，研究者將軟骨細胞親和肽(Cap)與溶酶體相關膜蛋白2b(Lamp2b)融合，對間充質干細胞(MSCs)來源的外泌體進行表面修飾，得到Cap-Exo。隨后，通過優化電穿孔法將ASPN-Cas9質粒裝載到Cap-Exo中，形成Cap-Exo/ASPN-Cas9復合物。

透射電子顯微鏡(TEM)顯示，Cap-Exo/ASPN-Cas9呈直徑約80-100納米的卵圓形囊泡。WB證實其表達外泌體標志蛋白TSG101、CD63、CD81，且Cap成功修飾于表面。納米流式細胞術分析顯示其平均粒徑為79.89納米，濃度約1.32×10¹⁰particles/mL。由于Cap帶正電荷，其Zeta電位為+1.7 mV，更利于與帶負電的軟骨結合。流式細胞術定量顯示，當使用4微克質粒/孔(6孔板)時，Cap的表面修飾效率約為79.1%。使用PicoGreen熒光法測定質粒裝載效率，結果顯示ASPN-Cas9質粒裝載入外泌體的效率為9.5% ± 0.6%。細胞攝取實驗顯示，用PKH67標記的Cap-Exo/ASPN-Cas9在軟骨細胞中顯示出比未修飾外泌體顯著更高的熒光信號強度，表明其靶向攝取效率更高。體內小動物熒光成像實驗也證實，經DiR標記的Cap-Exo/ASPN-Cas9在關節內注射后，在膝關節區域的熒光強度和保留時間均顯著長于非靶向組。

為評估Cap-Exo/ASPN-Cas9的抗炎效果，研究者檢測了其對巨噬細胞極化和炎癥因子表達的影響。流式細胞術顯示，脂多糖(LPS)/干擾素-γ(IFN-γ)誘導后，M1型巨噬細胞比例顯著增加至73.24%，而Cap-Exo/ASPN-Cas9處理可將其比例降至49.36%，與Exo/ASPN-Cas9效果相當，表明敲除ASPN可有效抑制M1型巨噬細胞極化。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)顯示，Cap-Exo/ASPN-Cas9能有效抑制軟骨細胞上清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、前列腺素E₂(PGE₂)、白介素-18(IL-18)和亞硝酸鹽的水平。WB和免疫熒光(IF)分析進一步證實，Cap-Exo/ASPN-Cas9可顯著降低由叔丁基過氧化氫(TBHP)誘導的炎癥蛋白[誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、環氧合酶2(COX2)、TNF-α]的高表達。

細胞外基質(ECM)降解是OA的核心特征。WB分析表明，Cap-Exo/ASPN-Cas9處理可顯著降低ECM降解關鍵酶[解整合素樣金屬蛋白酶4(ADAMTS4)、基質金屬蛋白酶13(MMP-13)]的表達，同時恢復聚蛋白聚糖(Aggrecan)和II型膠原(Collagen-II)的水平。qPCR結果與之一致。甲苯胺藍(TB)和番紅O(SO)染色顯示，Cap-Exo/ASPN-Cas9能有效對抗TBHP誘導的ECM降解。IF分析也表明，Cap-Exo/ASPN-Cas9能顯著恢復TBHP降低的Collagen-II熒光強度，并降低TBHP升高的MMP-13熒光強度。這些結果表明Cap-Exo/ASPN-Cas9能有效抑制ECM降解，維持軟骨細胞微環境穩態。

為探究ASPN敲除的分子機制，研究者對Cap-Exo/ASPN-Cas9處理的軟骨細胞進行了轉錄組測序。與對照組相比，共鑒定出2265個DEGs，其中上調1075個，下調1190個。有趣的是，核因子E2相關因子2(NFE2L2，即Nrf2)基因是上調基因之一。分子對接分析顯示，ASPN與Nrf2可通過8個氫鍵緊密結合。免疫共沉淀(Co-IP)實驗進一步在體外證實了ASPN與Nrf2之間存在相互作用。

WB實驗發現，在正常和OA條件下，敲低ASPN并不影響Nrf2的總蛋白表達量。然而，核質分離實驗顯示，在正常和TBHP條件下，敲低ASPN后，細胞核內Nrf2的量增加，而細胞質內Nrf2的量減少，這表明ASPN在細胞質中與Nrf2結合，減少了Nrf2進入細胞核�？寡趸�反應元件(ARE)熒光素酶報告基因檢測也證實，沉默ASPN可顯著增強ARE熒光素酶活性，即增強了Nrf2的轉錄活性。這些結果表明，ASPN通過與Nrf2結合，限制了其核轉位和轉錄活性。

進一步的基因集富集分析(GO)、京都基因與基因組百科全書(KEGG)和基因集富集分析(GSEA)表明，Cap-Exo/ASPN-Cas9處理顯著富集于與ECM組織、軟骨發育相關的通路，而與細胞衰老、鐵死亡相關的通路則顯著下調。這提示，ASPN敲除后減少Nrf2降解，可能通過抑制鐵死亡和細胞衰老來發揮其保護效應。

鐵死亡是一種鐵依賴性的程序性細胞死亡形式。研究表明，Cap-Exo/ASPN-Cas9處理能有效降低TBHP誘導的軟骨細胞內ROS水平、Fe²⁺積累和脂質過氧化，其效果與鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1(Fer-1)相當。WB分析顯示，在OA模型中，TBHP處理導致鐵死亡負調控蛋白[溶質載體家族7成員11(SLC7A11)、谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)、鐵蛋白重鏈1(FTH1)]表達下降，而正調控蛋白�；�輔酶A合成酶長鏈家族成員4(ACSL4)表達上升。Cap-Exo/ASPN-Cas9處理可顯著逆轉這些蛋白的表達變化。IF成像也證實，Cap-Exo/ASPN-Cas9能恢復TBHP降低的SLC7A11和GPX4熒光強度。

細胞衰老是OA的另一個重要特征。WB分析顯示，TBHP處理顯著增加了衰老相關蛋白(P53、P21、P16)的表達，而Cap-Exo/ASPN-Cas9處理可顯著抑制這種誘導。qPCR結果與之吻合。衰老相關β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色顯示，TBHP處理顯著增加了SA-β-Gal陽性細胞比例，而Cap-Exo/ASPN-Cas9處理則大幅降低了該比例。這些結果表明，Cap-Exo/ASPN-Cas9能有效抑制軟骨細胞的鐵死亡和細胞衰老。

Nrf2/HO-1通路是細胞抗氧化防御的核心。WB分析顯示，TBHP誘導的ROS升高顯著降低了細胞核內Nrf2(n-Nrf2)的水平，而Cap-Exo/ASPN-Cas9處理有效恢復了n-Nrf2的表達，并上調了下游抗氧化蛋白[血紅素加氧酶1(HO-1)、NAD(P)H:醌氧化還原酶1(NQO1)]。IF分析顯示Cap-Exo/ASPN-Cas9處理后Nrf2在細胞核內明顯積累。ARE熒光素酶報告基因實驗再次證實Cap-Exo/ASPN-Cas9可增強Nrf2轉錄活性。使用Nrf2特異性抑制劑ML385處理，可部分逆轉Cap-Exo/ASPN-Cas9對鐵死亡標志物GPX4和SLC7A11的調控作用，表明其效應依賴于Nrf2通路。

線粒體功能障礙與鐵死亡密切相關。TEM觀察發現，TBHP處理導致線粒體明顯腫脹、膜結構受損，而Cap-Exo/ASPN-Cas9處理極大地緩解了這些異常。WB分析顯示，Cap-Exo/ASPN-Cas9處理可上調線粒體融合相關蛋白[視神經萎縮蛋白1(OPA1)、線粒體融合蛋白1(MFN1)、線粒體融合蛋白2(MFN2)]的表達，下調線粒體分裂相關蛋白[動力相關蛋白1(DRP1)]的表達。線粒體超氧化物指示劑MitoSox染色顯示，Cap-Exo/ASPN-Cas9可顯著降低TBHP誘導的線粒體ROS生成。MitoTracker Red染色表明Cap-Exo/ASPN-Cas9恢復了受損的線粒體活性。JC-1染色評估線粒體膜電位(ΔΨm)顯示，TBHP處理顯著降低了線粒體膜電位，而Cap-Exo/ASPN-Cas9處理可使其恢復至接近基線水平。綜上所述，ASPN敲除通過激活Nrf2/HO-1通路，抑制軟骨細胞鐵死亡，緩解線粒體功能障礙，從而減少炎癥、ECM降解和細胞衰老。

為評估體內療效，研究者建立了內側半月板失穩(DMM)手術誘導的OA小鼠模型。術后每周進行關節腔內注射治療，持續四周。X射線和微型計算機斷層掃描(Micro-CT)評估顯示，DMM組關節出現明顯的骨贅形成、軟骨下骨硬化、小梁異常和關節間隙狹窄。Cap-Exo/ASPN-Cas9治療產生了最顯著的保護效果，能明顯減少骨贅、平滑關節面、增加小梁密度、擴大關節間隙，其效果接近FDA批準的OA藥物塞來昔布。

番紅O/固綠、甲苯胺藍和蘇木精-伊紅(H&E)染色顯示，DMM組軟骨顯著磨損、厚度變薄，OARSI評分高達5.67分，滑膜炎評分也最高。Cap-Exo/ASPN-Cas9治療可顯著拮抗軟骨降解，促進軟骨厚度恢復，將OARSI評分降至1.33分，并將滑膜炎評分顯著降低。免疫組織化學(IHC)分析進一步驗證了Cap-Exo/ASPN-Cas9在OA小鼠模型中的作用。DMM手術顯著減少了Nrf2陽性區域，增加了鐵死亡標志物ACSL4、MMP-13的表達，降低了II型膠原水平，并增加了炎癥標志物iNOS和COX2的表達。Cap-Exo/ASPN-Cas9治療顯著逆轉了這些病理變化。關節軟骨組織IF染色顯示，DMM模型中GPX4熒光強度大幅降低(對照組的0.23倍)，表明鐵死亡增強；Cap-Exo/ASPN-Cas9處理將GPX4水平恢復至約對照組的0.79倍。同時，Cap-Exo/ASPN-Cas9還能顯著降低滑膜中CD68(巨噬細胞標志物)的表達，并減少軟骨中DRP1的表達，表明其在體內也能緩解線粒體功能障礙。此外，衰老標志物P16的表達在DMM組顯著升高(2.19倍)，而Cap-Exo/ASPN-Cas9干預顯著降低了P16表達水平，緩解了軟骨細胞衰老。主要器官的組織病理學檢查未發現Cap-Exo/ASPN-Cas9給藥引起的可檢測到的全身毒性。

本研究發現ASPN是連接氧化還原失衡、鐵死亡、線粒體功能障礙和軟骨細胞衰老的關鍵上游調節因子。機制上，ASPN直接與細胞質中的Nrf2相互作用，限制其核轉位和轉錄活性，從而抑制Nrf2介導的抗氧化信號，使軟骨細胞更容易受到氧化應激的損害。ASPN敲除顯著減少了ASPN-Nrf2結合，恢復了Nrf2核積累，增強了抗氧化反應。Nrf2活性抑制的下游后果之一是促進了鐵死亡。本研究中，通過Cap-Exo/ASPN-Cas9敲除ASPN，可顯著減輕脂質過氧化和鐵過載，通過重新激活Nrf2/HO-1抗氧化軸來抑制鐵死亡。線粒體功能障礙是氧化應激和鐵死亡之間的關鍵交匯點。Cap-Exo/ASPN-Cas9治療可 substantially 恢復線粒體完整性，并重新平衡線粒體動力學。持續的氧化應激、鐵死亡和線粒體功能障礙共同驅動軟骨細胞衰老。Cap-Exo/ASPN-Cas9治療顯著減少了SA-β-Gal陽性細胞，并下調了p16和p21的表達。這些抗衰老效應與鐵死亡應激減少和線粒體功能恢復相吻合。

本研究也存在一些局限性。首先，外泌體遞送策略的裝載效率和穩定性仍需進一步優化。其次，盡管外泌體提高了遞送特異性，但軟骨穿透有限、滑膜清除、在深層軟骨區保留不足等挑戰仍未解決。未來的工程策略可能需要同時實現組織和細胞特異性靶向。再者，ASPN與Nrf2相互作用的具體分子機制尚未完全闡明，需要未來在機制研究中進一步驗證。最后，雖然體內外實驗證實了Cap-Exo/ASPN-Cas9的短期安全性和生物相容性，但仍需更全面的評估。

本研究表明，Cap-Exo/ASPN-Cas9在體內外對OA均具有顯著的保護作用。ASPN敲除有效減少了Nrf2降解，激活了Nrf2/HO-1通路，并抑制了軟骨細胞的鐵死亡。此外，Cap-Exo/ASPN-Cas9治療緩解了線粒體功能障礙，減輕了炎癥，維持了軟骨細胞微環境穩態，減少了細胞衰老，從而延緩了OA進展。因此，靶向CRISPR-Cas9介導的ASPN缺失代表了一種新穎且有前景的OA治療方法，為未來的治療策略奠定了基礎。