《Chinese Medicine》：Shuxuening injection improves ventricular remodeling after myocardial infarction by indirectly promoting macrophage-mediated angiogenesis and lymphangiogenesis
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本研究首次闡明舒血寧注射液(SXNI)通過激活巨噬細胞分泌VEGF-A和VEGF-C，間接激活內皮細胞VEGFR2/VEGFR3通路，促進血管與淋巴管新生，從而減輕心肌水腫、炎癥與纖維化，改善心肌梗死后心室重構。該研究從“間接藥理學”視角揭示了SXNI的多靶點、多通路作用機制，為其臨床應用提供了新的理論依據。
背景與目的
心肌梗死(MI)是由于冠狀動脈阻塞導致心肌缺血壞死，進而引發心室重構、心功能下降的重大心血管疾病。盡管再灌注治療如經皮冠狀動脈介入治療(PCI)和冠狀動脈旁路移植術(CABG)可恢復血流，但再灌注損傷以及部分患者不適宜此類治療，使得尋找新的治療策略尤為迫切。血管新生和淋巴管新生在MI后修復中至關重要，前者可恢復缺血區血液灌注，后者則有助于引流組織液、減輕水腫和炎癥。舒血寧注射液(SXNI)是臨床上常用于治療心血管疾病的中藥注射劑，但其改善MI后心室重構的具體機制尚未明確。本研究旨在探討SXNI對MI后心室重構的影響，并闡明其作用機制，特別是從巨噬細胞介導的間接調節角度入手。
研究方法
研究采用大鼠MI模型（結扎左前降支冠狀動脈），將大鼠分為假手術組、模型組、SXNI低劑量組(1.05 mL/kg/d)、臨床等效劑量組(2.1 mL/kg/d)、高劑量組(4.2 mL/kg/d)以及陽性藥卡托普利組。治療持續4周。藥效學評估包括心臟超聲檢測心功能（左心室射血分數LVEF、左心室短軸縮短率LVFS等）、測量梗死面積、Masson染色評估纖維化、TUNEL染色檢測細胞凋亡。通過免疫組化染色CD31和LYVE-1分別評估血管新生和淋巴管新生，使用Western blot、qRT-PCR和ELISA檢測VEGF-A、VEGF-C及其受體VEGFR2、VEGFR3的表達與活化，以及下游信號分子p-AKT、p-ERK的水平。體外實驗使用人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)、小鼠淋巴內皮細胞(SVEC4-10)和巨噬細胞(Raw264.7)。通過CCK-8、劃痕實驗和管形成實驗，分別檢測SXNI對細胞活力、遷移和成管能力的直接作用，以及經SXNI處理的巨噬細胞條件培養基對HUVEC和SVEC4-10細胞的間接影響。采用超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱質譜(UPLC-QE-MS)鑒定SXNI的化學成分，并通過分子對接篩選能與VEGF-A/VEGF-C蛋白結合的關鍵成分，最后通過細胞實驗驗證這些成分對巨噬細胞分泌VEGF-A和VEGF-C的調節作用。
研究結果
1. SXNI改善MI大鼠心功能并抑制心室重構
與模型組相比，SXNI臨床等效劑量(2.1 mL/kg)和高劑量(4.2 mL/kg)治療能顯著提高LVEF和LVFS，降低左心室收縮末期內徑(LVID s)和舒張末期內徑(LVID d)，減輕心臟肥大指標(心重/體重比)，縮小心肌梗死面積，減少心肌膠原沉積和纖維化區域，并降低血清腦鈉肽(BNP)水平。此外，SXNI還能顯著抑制心肌細胞凋亡，下調促凋亡蛋白BAX和cleaved-caspase-3的表達，上調抗凋亡蛋白BCL-2的表達。
2. SXNI促進血管與淋巴管新生，減輕心肌水腫和炎癥
SXNI治療顯著增加了心肌梗死邊緣區CD31+微血管密度和LYVE-1+淋巴管密度。同時，SXNI降低了心臟組織含水量，并降低了血清中促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6的水平。這表明SXNI通過促進血管新生和淋巴管新生，改善了心肌灌注并減輕了水腫和炎癥反應。
3. SXNI激活VEGF-A/VEGFR2和VEGF-C/VEGFR3信號通路
在體內，SXNI處理增加了心肌組織和血清中VEGF-A和VEGF-C的蛋白水平。Western blot分析顯示，SXNI上調了心臟組織中VEGF-A、p-VEGFR2、VEGF-C和VEGFR3的蛋白表達，并激活了下游的p-AKT和p-ERK信號。
4. SXNI的促血管/淋巴管新生作用通過巨噬細胞間接介導
體外實驗發現，SXNI直接處理對HUVEC和SVEC4-10細胞的增殖、遷移和管形成能力無顯著影響。然而，SXNI能劑量依賴性地促進Raw264.7巨噬細胞中Vegf-a和Vegf-c的mRNA表達以及VEGF-A和VEGF-C蛋白的分泌。用SXNI處理過的巨噬細胞條件培養基培養HUVEC和SVEC4-10細胞，則能顯著促進后者的增殖、遷移和管形成能力。進一步的機制研究表明，該條件培養基能激活HUVEC細胞中的p-VEGFR2、p-AKT和p-ERK信號，以及SVEC4-10細胞中的VEGFR3、p-AKT和p-ERK信號。這證實了SXNI是通過激活巨噬細胞，使其分泌VEGFs，進而間接作用于內皮細胞并激活相關信號通路。
5. 鑒定SXNI中激活巨噬細胞的關鍵活性成分
通過UPLC-QE-MS從SXNI中鑒定出70種化學成分。分子對接分析發現，銀杏內酯A (ginkgolide A)、銀杏內酯B (ginkgolide B)、蘆丁 (rutin) 和槲皮素3-新橙皮糖苷 (quercetin 3-neohesperidoside) 與VEGF-A和VEGF-C蛋白具有較強的結合潛力。細胞實驗證實，這四種化合物均能不同程度地上調Raw264.7細胞中Vegf-a和Vegf-c的mRNA表達，并促進VEGF-A和VEGF-C蛋白的分泌，其中銀杏內酯A和銀杏內酯B的作用尤為顯著。
結論
本研究揭示，舒血寧注射液并非直接作用于血管或淋巴管內皮細胞，而是通過激活巨噬細胞，促進其分泌VEGF-A和VEGF-C等細胞因子，進而間接激活內皮細胞中的VEGFR2/AKT/ERK和VEGFR3/AKT/ERK信號通路，雙管齊下地促進血管新生和淋巴管新生。這一過程有助于恢復心肌灌注、減輕組織水腫和炎癥、抑制纖維化和細胞凋亡，最終改善MI后的心室重構和心臟功能。銀杏內酯A、銀杏內酯B、蘆丁和槲皮素3-新橙皮糖苷被認為是SXNI中實現上述巨噬細胞激活作用的關鍵活性成分。該工作從“間接藥理學”和免疫調節的新視角，闡明了SXNI治療MI的多成分、多靶點、多通路作用機制，為其臨床應用提供了重要的實驗依據和理論支撐。
