背景

通過改造釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）以利用木糖，是提高通過戊糖發(fā)酵生產(chǎn)第二代乙醇（2G）的發(fā)酵效率的關(guān)鍵。為此，主要策略之一是表達(dá)異源木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，以確保這種糖的有效吸收。然而，由于糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白本身的非特異性，不同糖類（如木糖和葡萄糖）之間會存在競爭，從而導(dǎo)致戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)效率降低，乙醇產(chǎn)量減少。本研究旨在通過遺傳改良Trichoderma reesei的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并將其異源表達(dá)在S. cerevisiae中，從而開發(fā)出對葡萄糖親和力較低但仍能轉(zhuǎn)運(yùn)木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。為此，研究人員對比了已知對木糖轉(zhuǎn)運(yùn)重要的基序，并預(yù)測了可能具有磷酸化位點(diǎn)的位置。基于這些預(yù)測，對轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行了建模，并將其與葡萄糖和木糖進(jìn)行了對接分析。具有所需表型的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在S. cerevisiae菌株中表達(dá)并進(jìn)行表征。通過滴定實(shí)驗(yàn)和好氧發(fā)酵試驗(yàn)驗(yàn)證了預(yù)測的結(jié)果。計(jì)算機(jī)模擬分析顯示，Str3（Tr62380）中的兩個(gè)突變表現(xiàn)出良好的表型。對于尚未進(jìn)行表征的Tr82309，決定先對其野生型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行表征。

結(jié)果

滴定實(shí)驗(yàn)顯示，所測試的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在生長表型上存在顯著差異。對接分析僅作為一種定性的、用于生成假設(shè)的工具，用于優(yōu)先選擇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測試的突變，并不用于預(yù)測轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)或底物親和力。Str3（Tr62380）的突變體確實(shí)失去了對己糖的天然親和力。此外，Tr82309在液體培養(yǎng)基中的活性有限，但在固體培養(yǎng)基中較高濃度的木糖條件下仍能支持生長，這表明其功能可能依賴于具體條件，而非具有確定的底物特異性。在好氧發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，只有Str3（Tr62380）_WT菌株表現(xiàn)出從培養(yǎng)基中高效吸收糖的能力；而插入Str3（Tr62380）中的突變降低了其轉(zhuǎn)運(yùn)糖的能力，尤其是葡萄糖的能力。磷酸化模擬實(shí)驗(yàn)證明了翻譯后修飾可以影響糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物利用特性。

結(jié)論

對接分析作為一種定性篩選步驟，有助于指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所需的突變選擇。我們還提出了磷酸化位點(diǎn)作為糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白工程研究的新目標(biāo)。然而，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證是必不可少的。總之，我們的發(fā)現(xiàn)為開發(fā)對葡萄糖不敏感的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提供了合理的框架，從而提高了生物精煉廠中糖的共發(fā)酵效率。