摘要

背景

Enterocytozoon bieneusi是一種專性細(xì)胞內(nèi)微孢子蟲病原體。它主要導(dǎo)致感染者出現(xiàn)腹瀉和體重下降，給畜牧業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，建立一種高靈敏度和特異性的檢測(cè)方法對(duì)于預(yù)防和控制這種病原體至關(guān)重要。

方法

基于E. bieneusi的18S核糖體RNA基因和內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）的部分序列，設(shè)計(jì)了crRNA和重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）引物。從糞便樣本中提取的DNA通過(guò)RPA或嵌套聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)Tris飽和苯酚-氯仿-異戊醇混合物處理以獲得純化的目標(biāo)DNA，隨后將其引入CRISPR–Cas12a反應(yīng)系統(tǒng)。反應(yīng)后的檢測(cè)通過(guò)qPCR儀器、熒光觀察和側(cè)向流動(dòng)條（LFS）試驗(yàn)進(jìn)行。通過(guò)RPA/CRISPR–Cas12a或嵌套PCR/CRISPR–Cas12a平臺(tái)優(yōu)化了E. bieneusi檢測(cè)的操作參數(shù)。該方法使用50份已知E. bieneusi感染狀態(tài)的臨床樣本進(jìn)行了驗(yàn)證。

結(jié)果

RPA/CRISPR–Cas12a的檢測(cè)限為7.13拷貝/μL，嵌套PCR/CRISPR–Cas12a的檢測(cè)限為2.35 × 10^?2拷貝/μL。當(dāng)CRISPR–Cas12a反應(yīng)系統(tǒng)中未擴(kuò)增DNA的濃度達(dá)到≥1 × 10^?4 μg/μL時(shí)，單鏈DNA報(bào)告基因會(huì)被有效切割，產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)。使用嵌套PCR/CRISPR–Cas12a技術(shù)分析了50份確認(rèn)為E. bieneusi陽(yáng)性或陰性的糞便樣本。基于儀器的檢測(cè)結(jié)果、熒光觀察和側(cè)向流動(dòng)條檢測(cè)結(jié)果完全一致。

結(jié)論

我們首次實(shí)現(xiàn)了嵌套PCR與CRISPR–Cas12a的結(jié)合，用于檢測(cè)E. bieneusi，同時(shí)也是首次使用未擴(kuò)增的E. bieneusi DNA定量探索Cas12a的檢測(cè)限。該方法提供了一種快速、特異且高度敏感的診斷手段。此外，多種適當(dāng)?shù)目梢暬�方法的選擇使其能夠適應(yīng)不同的實(shí)驗(yàn)室條件和樣本模板濃度，從而確保結(jié)果的準(zhǔn)確解讀。