基孔肯雅病毒（CHIKV）和登革熱病毒（DENV）的感染癥狀非常相似，但需要不同的管理策略，這凸顯了快速、準確的鑒別診斷方法的迫切需求。目前金標準方法——逆轉(zhuǎn)錄定量實時PCR（RT-qPCR）存在顯著局限性：它依賴于昂貴的熱循環(huán)儀、復(fù)雜的實驗室設(shè)施和專業(yè)人員，因此在資源有限的環(huán)境或現(xiàn)場篩查中難以應(yīng)用。為了解決這一技術(shù)瓶頸，本研究開發(fā)了一種基于CRISPR-Cas12a/Cas13a雙酶切割系統(tǒng)的便攜式、不依賴儀器的快速檢測技術(shù)。通過精確設(shè)計針對CHIKV E1基因和DENV 3′-UTR區(qū)域的特異性crRNA，并將其與逆轉(zhuǎn)錄重組酶輔助擴增（RT-RAA）技術(shù)結(jié)合，我們建立了一種能夠在等溫條件下進行核酸擴增和檢測的集成反應(yīng)系統(tǒng)。該技術(shù)的核心機制如下：當(dāng)識別到相應(yīng)的病毒靶標時，Cas12a（針對CHIKV）和Cas13a（針對DENV）被激活并切割熒光報告分子或側(cè)向流動條報告探針，從而實現(xiàn)可視化檢測。梯度稀釋的病毒核酸測試表明，能夠產(chǎn)生信號的最低可檢測濃度為102拷貝/mL，這與qPCR的結(jié)果相當(dāng)。臨床模擬樣本驗證顯示，該系統(tǒng)與qPCR的結(jié)果完全一致（100%一致），并且能夠準確區(qū)分單一感染和共感染。本研究建立的CRISPR雙酶切割技術(shù)有效規(guī)避了qPCR對先進設(shè)備的依賴，提供了一種快速、簡單且低成本的CHIKV/DENV鑒別診斷方法。這對早期預(yù)防和控制蟲媒病毒疾病具有重要的實際價值。