《Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis》：Effect of p53 gene mutation with loss of function on the expression of genes and proteins involved in cell proliferation
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CRISPR/Cas9敲除TP53基因?qū)е翲T1080細(xì)胞中細(xì)胞周期調(diào)控蛋白和腫瘤相關(guān)蛋白顯著下降，結(jié)構(gòu)建模顯示蛋白結(jié)構(gòu)改變，β-gal活性升高提示衰老，為靶向p53治療提供依據(jù)。
Gyeong Hee Kim | Moon-Moo Kim
應(yīng)用化學(xué)、食品科學(xué)與技術(shù)系，東義大學(xué)，韓國(guó)釜山47340
摘要
腫瘤抑制基因TP53通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程、DNA修復(fù)機(jī)制和細(xì)胞凋亡，在維持基因組完整性方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本研究旨在探討CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的p53基因功能喪失突變?nèi)绾斡绊慔T1080人類纖維肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和致癌信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。通過(guò)Sanger測(cè)序證實(shí)了TP53基因的破壞，而使用AlphaFold2和ChimeraX進(jìn)行的結(jié)構(gòu)建模顯示，與野生型相比，預(yù)測(cè)的TP53蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。通過(guò)RT-PCR和qPCR進(jìn)行的基因表達(dá)分析表明，修飾后的細(xì)胞中TP53 mRNA的表達(dá)顯著下降。盡管發(fā)生了突變，但編輯后的細(xì)胞中衰老標(biāo)志物β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）的活性卻升高了。這些變化表明，CRISPR/Cas9引起的結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致了TP53功能性的喪失。Western blotting和免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，與野生型相比，編輯后的細(xì)胞中關(guān)鍵的細(xì)胞周期和致癌相關(guān)蛋白（包括TP53、磷酸化TP53（p-TP53）、乙酰化TP53（ac-TP53）、MMP-2、cyclin D、cyclin E、AKT、BAX和磷酸化Rb（p-Rb）的表達(dá)顯著下調(diào)。我們的結(jié)果表明，TP53突變可能會(huì)破壞與細(xì)胞增殖和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵通路。這為理解TP53的功能提供了新的見(jiàn)解，并強(qiáng)調(diào)了其在癌癥生物學(xué)中作為治療靶點(diǎn)的潛力。
引言
癌癥是一種復(fù)雜且異質(zhì)性強(qiáng)的疾病，會(huì)影響多個(gè)器官，全球每年導(dǎo)致約一千萬(wàn)人死亡[1]。癌癥的一個(gè)特征是細(xì)胞不受控制地生長(zhǎng)，并伴有異常細(xì)胞的廣泛擴(kuò)散[2]。腫瘤的發(fā)展會(huì)破壞正常的細(xì)胞過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失控、逃避生長(zhǎng)抑制信號(hào)、對(duì)程序性細(xì)胞死亡的抵抗以及獲得轉(zhuǎn)移能力[3]。在這個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)中，p53腫瘤抑制基因起著關(guān)鍵作用[4]。p53的活性可由多種細(xì)胞應(yīng)激因素觸發(fā)，包括DNA損傷、缺氧和致癌信號(hào)傳導(dǎo)[5]。p53通過(guò)阻止細(xì)胞周期進(jìn)程、促進(jìn)DNA修復(fù)或在不可逆損傷的情況下誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)決定細(xì)胞的命運(yùn)[6]。
在腫瘤學(xué)領(lǐng)域，恢復(fù)p53的功能已被認(rèn)為是一種潛在的治療途徑[7]。TP53突變是多種癌癥中最常見(jiàn)的基因改變之一，與多種癌癥（包括肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胰腺癌和肝膽癌）的不良臨床結(jié)果密切相關(guān)[8]。了解調(diào)節(jié)惡性細(xì)胞細(xì)胞周期調(diào)控的分子機(jī)制對(duì)于開(kāi)發(fā)更有效的治療策略至關(guān)重要[9]。最近的研究集中在靶向MDMX-p53相互作用以抑制腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展并改善臨床結(jié)果[10]。在這些機(jī)制中，MDM2通過(guò)直接與p53結(jié)合，促進(jìn)其泛素化并通過(guò)蛋白酶體途徑進(jìn)行降解，從而在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中促進(jìn)p53的降解，降低其轉(zhuǎn)錄活性并增強(qiáng)其核輸出，從而有效抑制p53的腫瘤抑制功能[11]。
p53因其能夠通過(guò)誘導(dǎo)介導(dǎo)細(xì)胞周期停滯的基因的活性來(lái)調(diào)節(jié)G1檢查點(diǎn)而廣受認(rèn)可[12]。為了在MDM2抑制的腫瘤中恢復(fù)p53的活性，最近開(kāi)發(fā)了一種新型抗癌肽，該肽能夠靶向MDM2，有效重新激活p53并防止腫瘤進(jìn)展[13]。此外，包括Cyclin E、K-Ras和Myc在內(nèi)的致癌蛋白的致癌激活會(huì)抑制p53和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（Rb）蛋白等關(guān)鍵腫瘤抑制因子的活性，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的無(wú)控制增殖[14]。當(dāng)負(fù)責(zé)響應(yīng)DNA損傷的細(xì)胞通路（DDR）受損時(shí)，尤其是由于p53、ATM和其他相關(guān)成分的基因改變和失調(diào)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定。此外，像Myc和CDK2這樣的致癌基因與Cyclin E的異常激活，以及檢查點(diǎn)控制蛋白（如ATR-CHK1）的功能喪失，會(huì)破壞轉(zhuǎn)錄調(diào)控，導(dǎo)致復(fù)制壓力。
這些改變會(huì)引發(fā)轉(zhuǎn)錄-復(fù)制沖突，進(jìn)一步加劇基因組不穩(wěn)定并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[15]。雖然野生型p53在突變形式下仍保留部分功能，但通過(guò)MDM2/MDM4抑制劑靶向p53的降解途徑提供了有希望的治療策略，特別是在那些TP53突變率較高或MDM2/MDM4過(guò)度表達(dá)的腫瘤中[16]。鑒于p53在控制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的關(guān)鍵作用，迫切需要開(kāi)發(fā)能夠直接或間接恢復(fù)其腫瘤抑制功能的治療干預(yù)措施。然而，盡管取得了顯著進(jìn)展，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的TP53刪除對(duì)基因表達(dá)譜和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的具體影響仍不甚清楚。因此，進(jìn)一步研究靶向p53丟失的分子和細(xì)胞后果對(duì)于深入理解p53在癌癥生物學(xué)中的功能意義以及設(shè)計(jì)更有效的治療方法至關(guān)重要。
本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)建立了TP53突變細(xì)胞系，以研究p53在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中的作用。CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過(guò)引導(dǎo)RNA（gRNA）精確靶向基因組區(qū)域，該gRNA與protospacer相鄰基序（PAM，5'-NGG-3'）相鄰的序列結(jié)合[17]。設(shè)計(jì)了一種20個(gè)核苷酸長(zhǎng)的gRNA，專門針對(duì)TP53基因進(jìn)行靶向。已知HT1080人類纖維肉瘤細(xì)胞具有強(qiáng)烈的致癌潛能和編輯前的完整p53信號(hào)傳導(dǎo)，成功將其轉(zhuǎn)染以創(chuàng)建TP53突變克隆。然后使用這些缺乏p53的HT1080細(xì)胞來(lái)研究TP53丟失的功能后果，重點(diǎn)關(guān)注細(xì)胞周期進(jìn)程的變化、衰老表型和致癌信號(hào)通路的變化。
部分內(nèi)容片段
化學(xué)品
Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）、胰蛋白酶-EDTA以及含有青霉素、鏈霉素和兩性霉素（分別為10,000 U/mL、10,000 μg/mL和2500 μg/mL）的抗生素混合物，以及胎牛血清（FBS）均購(gòu)自Gibco BRL（英國(guó)佩斯利）。HT1080人類纖維肉瘤細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)弗吉尼亞州馬納薩斯的美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏中心（ATCC）。MTT試劑、瓊脂糖和經(jīng)過(guò)DEPC處理的脫脂牛奶均來(lái)自相同供應(yīng)商。
pX459-p53 sgRNA載體系統(tǒng)的構(gòu)建
pX459載體含有p53 sgRNA，經(jīng)過(guò)修改后能夠在p53基因的一個(gè)外顯子內(nèi)實(shí)現(xiàn)靶向刪除。這種包含p53 sgRNA的修改后的pX459載體隨后被引入HT1080細(xì)胞中。pX459構(gòu)建體具有雙BsbI限制性位點(diǎn)，指定了p53 sgRNA的靶向區(qū)域，Sanger測(cè)序比對(duì)的結(jié)果證實(shí)了pX459質(zhì)粒載體的準(zhǔn)確組裝。
討論
本研究使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除了HT1080細(xì)胞中的p53基因，旨在探索其對(duì)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的影響及其在癌癥治療中的潛在意義。敲除導(dǎo)致TP53在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的完全丟失，進(jìn)而引起細(xì)胞周期進(jìn)程的顯著變化、衰老的誘導(dǎo)以及細(xì)胞外基質(zhì)的重塑。癌細(xì)胞的失控增殖源于...
倫理聲明
本研究未涉及人類參與者或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)象，因此無(wú)需機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。
資助
本研究得到了韓國(guó)國(guó)家研究基金會(huì)（NRF，編號(hào)RS-2017-NR027943）和韓國(guó)教育部的基礎(chǔ)科學(xué)研究計(jì)劃的支持。
CRediT作者貢獻(xiàn)聲明
Moon-Moo Kim：撰寫 – 審稿與編輯、驗(yàn)證、軟件使用、方法論、數(shù)據(jù)管理、概念構(gòu)思。
Gyeong Hee Kim：撰寫 – 原始草稿、數(shù)據(jù)可視化、驗(yàn)證、方法論、數(shù)據(jù)管理、概念構(gòu)思。
