《Plant Cell Reports》：Transgene-free genome editing in citrus and poplar meristem tissues via biolistic ribonucleoprotein delivery of CRISPR-Cas9
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本研究旨在解決傳統組織培養方法難以轉化、難以獲得無外源轉基因植物的多年生木本植物的基因組編輯難題。研究人員采用基因槍介導的粒子轟擊法，將CRISPR-Cas9 RNP（核糖核蛋白復合體）直接遞送至柑橘莖尖分生組織(SAM)和楊樹腋生分生組織(AXM)中，成功在CsNPR3和Pt4CL1基因位點產生了定向突變，并獲得了嵌合體編輯植株。該工作建立了一種可行的、創新的無外源轉基因植物生產框架，為林木育種提供了新策略。
基因組編輯技術，特別是CRISPR/Cas9系統，為植物遺傳改良帶來了革命性的潛力。然而，對于多年生木本植物，尤其是那些對常規組織培養不敏感或再生的物種，如何高效、無外源基因地實現基因組編輯，一直是科研人員面臨的重大挑戰。傳統的基于DNA載體的轉化方法不僅效率低下，還會將外源基因（即轉基因）整合到植物基因組中，這可能引發公眾擔憂并給后續的監管審批與商業化應用帶來障礙。因此，開發一種能夠繞開組織培養、直接對植物細胞進行編輯且不遺留外源DNA的技術，對于林木等多年生植物的遺傳改良具有迫切需求。
研究者們將目光投向了植物體內一群特殊的“干細胞”——分生組織。這些組織位于植物的莖尖或葉腋等處，由具有全能性、高度再生能力的細胞組成，是植物持續生長和新器官形成的源泉。針對這些細胞的編輯，有望將突變直接傳遞給整個植株甚至下一代。本研究發表在《Plant Cell Reports》上，探索了利用基因槍法（又稱粒子轟擊法）將基因組編輯試劑直接遞送至分生組織的可能性，并以柑橘和楊樹這兩種具有重要經濟價值但傳統遺傳轉化困難的木本植物為研究對象，旨在建立一套無外源轉基因（transgene-free）的基因組編輯新體系。
為開展此項研究，研究人員主要運用了以下關鍵方法：首先，以基因槍（biolistic particle bombardment）技術作為遞送手段。其次，遞送的編輯試劑主要為CRISPR/Cas9核糖核蛋白復合體（RNP），并與基于DNA質粒的遞送方式進行對比。第三，實驗選用柑橘成熟種子的莖尖分生組織（SAM）和楊樹離體培養枝條的腋生分生組織（AXM）作為受體材料。最后，通過測序技術（包括桑格測序和高通量測序）和體外切割實驗來評估編輯效率和靶點活性。
研究結果與發現
1. 基于GFP載體驗證基因槍轉化效率
研究人員首先使用一個表達綠色熒光蛋白（GFP）的質粒載體（pYPQ131-eGFP）來驗證和優化粒子轟擊參數。通過檢測熒光信號（），并結合PCR及桑格測序驗證，他們發現柑橘分生組織獲得了極高的平均轉化效率（87.9%），楊樹的平均效率為13%。這證明了基因槍法能夠成功地將外源DNA導入目標分生組織細胞。
2. 基于DNA質粒的基因組編輯嘗試失敗
隨后，研究團隊改用包含CRISPR/Cas9編輯元件的DNA質粒載體（pLR5468和pLR5469）進行轉化，靶向柑橘的CsPDS和CsNPR3基因。雖然獲得了轉基因植株，但未觀察到CsPDS基因敲除后預期的白化表型。通過下一代測序（NGS）分析CsNPR3基因，也未檢測到任何突變。這表明基于DNA質粒的遞送可能因載體大小、DNA片段化或不穩定等原因，未能有效地將功能完整的編輯系統遞送到細胞中。
3. 轉向RNP遞送實現無外源轉基因編輯
鑒于DNA遞送的局限性，研究轉向了CRISPR-Cas9核糖核蛋白復合體（RNP）的遞送。RNP是預先在體外組裝好的Cas9蛋白和指導RNA的復合物，具有瞬時作用、無需DNA整合的優勢，是實現無外源轉基因編輯的理想選擇。
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對于柑橘，研究人員設計了靶向CsNPR3和CsPDS基因的sgRNA（單向導RNA），并通過體外切割實驗驗證了其活性（）。然后將純化的Cas9蛋白與sgRNA混合形成RNP，通過基因槍遞送到柑橘莖尖分生組織。
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實驗結果顯示，通過RNP遞送成功在CsNPR3位點獲得了編輯植株，盡管這些植株是嵌合體（即只有部分細胞被編輯）。對葉片的混合樣本和單葉樣本進行測序分析，鑒定出T或A單核苷酸插入的突變，最高編輯效率達到4.95%。這證明了RNP遞送能夠產生可遺傳的突變。
4. 在楊樹中成功應用RNP編輯
類似地，研究人員在楊樹中應用了相同的策略，靶向Pt4CL1基因。體外切割實驗顯示靶向Pt4CL1的sgRNA活性良好。通過基因槍將相應的RNP遞送至楊樹腋生分生組織后，成功獲得了六個嵌合編輯植株，這些植株在切割位點同樣存在單核苷酸插入或缺失，其中一株的編輯效率超過1%。這表明該技術方法同樣適用于楊樹等其他木本物種。
結論與重要意義
本研究通過創新的遞送策略，成功地將CRISPR-Cas9核糖核蛋白復合體（RNP）直接導入柑橘和楊樹的分生組織，首次實現了在這兩種木本植物中通過非DNA遞送方式獲得無外源轉基因的基因組編輯植株。盡管目前得到的編輯植株多為嵌合體，編輯效率有待提高，但這項研究證明了其概念上的可行性。該方法的成功具有重要意義：
首先，它提供了一種克服木本植物組織培養和再生障礙的新途徑。其次，RNP遞送避免了外源DNA的整合，所得編輯植株不含有轉基因，這極大地簡化了未來監管審批流程，有利于相關品種的商業化推廣。最后，該研究建立了一個通用性框架，有潛力推廣到其他遺傳轉化困難的多年生作物或林木中。正如作者所指出的，通過后續的不斷剪枝、篩選等傳統園藝手段，有望從這些嵌合體中獲得穩定遺傳的純合突變株系，從而為林木的精準育種和性狀改良開辟了一條充滿希望的道路。
