細胞外囊泡（EVs）是由幾乎所有細胞分泌的膜包被納米結構，攜帶蛋白質、脂質、核酸等活性分子，在細胞間通信中扮演關鍵角色。其內容物反映親本細胞的生理或病理狀態，因此在診斷、預后及治療應用中展現出巨大潛力。EVs主要包括外泌體與微泡等亞型，它們在尺寸、生物發生及分子組成上有所不同。在血液等生物體液中濃度很高，且水平隨疾病狀態波動。

在血液惡性腫瘤中，B細胞淋巴瘤是一類異質性疾病，其中彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）是最常見的亞型，約占新診斷非霍奇金淋巴瘤的40%。DLBCL具有顯著的異質性，基于基因表達譜可分為生發中心B細胞樣（GCB）和活化B細胞樣（ABC）兩大分子亞型。目前的基因分型方法（如基因表達譜分析）存在組織樣本獲取不便、RNA降解等局限。液體活檢作為一種微創技術，利用循環生物標志物（包括細胞游離DNA、循環腫瘤細胞和EVs）進行分子分析，正成為克服這些局限的新途徑。其中，EVs因其在循環中持續存在且能反映腫瘤特異性分子特征而備受關注。然而，對淋巴瘤EVs及其在患者樣本混合EVs中檢測B細胞特異性標志物的研究仍不足，了解其在識別B細胞特異性EV特征方面的潛力至關重要。

EVs的分離與分析因其納米級尺寸及血漿或血清等生物基質的復雜性而面臨挑戰。這些挑戰在DLBCL研究中尤為突出，血清與細胞培養來源EVs的表征技術直接比較有限，分離方案和分析目標的不一致進一步阻礙了可重復性和標準化工作流程的建立。研究血液來源的EVs對于獲得臨床可轉化的發現至關重要，而細胞系來源的EVs對于機制研究和生物標志物發現仍然不可或缺。當前EV研究在表征技術（如納米顆粒追蹤分析（NTA）、透射電鏡（TEM）、質譜（MS）、蛋白質印跡（WB）和酶聯免疫吸附測定（ELISA）等免疫分析）的使用上差異顯著，導致數據不一致，使跨研究比較復雜化。四跨膜蛋白（如CD9、CD63和CD81）的表達譜被用來評估不同樣本類型中EV的富集度、純度和異質性，并有助于對EV群體進行分類。

本研究聚焦于DLBCL及其兩個主要亞型的EV特征，以及淋巴瘤患者血清EVs。通過評估關鍵參數，如EV蛋白質組、四跨膜蛋白的特異性表達以及淋巴瘤特異性標志物（CD19和CD20），比較了不同分析技術的相對性能和局限性。盡管樣本量有限，這項方法學研究為開發用于淋巴瘤分析和未來潛在患者分層的非侵入性方法提供了見解。

研究使用了四種DLBCL細胞系：U-2932（U-2）和Riva（Ri）屬于ABC亞型；SUDHL-4（S-4）和OCI-LY7（O-7）屬于GCB亞型。細胞在添加10%胎牛血清（實驗前使用無外泌體血清）和1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養基中培養。收集條件培養基，通過離心去除細胞碎片，并使用10 kDa截留分子量的離心過濾器濃縮，然后進行高速離心去除殘余碎片。EV富集的上清液立即進行基于尺寸排阻色譜（SEC）的EV分離或儲存于-80°C備用。

在獲得倫理批準（編號72/1801/2018）后，收集了四名B細胞淋巴瘤患者（包括DLBCL、霍奇金淋巴瘤和小淋巴細胞淋巴瘤）的血清樣本。靜脈血采集至EDTA管中，分離血清并儲存于-80°C。

使用qEV single Gen2 70 nm SEC柱從濃縮的細胞培養上清液和血清樣本中分離EVs。上樣150 μL樣本，收集餾分1-8，并將每兩個連續餾分合并為最終的四個樣品F1-F4。為下游分析，將合并的餾分F1-F3（來自SEC的餾分1-6）合并為一個管，餾分F4不包含在下游分析中。收集的EV餾分使用Amicon蛋白濃縮器（10 kDa MWCO）進行濃縮，通過NanoDrop分光光度計測量蛋白質濃度，樣品儲存于-80°C。

采用標準化負染方案進行TEM觀察EVs。優化后的方案使用1%乙酸雙氧鈾染色1分鐘，以獲取更佳圖像對比度。將固定后的EV樣品置于碳涂層銅網上，染色后空氣干燥，使用JEM-1400透射電鏡在80 kV下成像。

為了檢測EV表面標志物，對細胞培養和患者血清來源的EVs進行了免疫金標記。碳涂層銅網經等離子體處理以增強親水性。固定的EV樣品置于封閉液中孵育，然后與小鼠抗人CD9或CD81一抗孵育，接著與10 nm金標記的驢抗小鼠二抗孵育。最后用1%戊二醛固定，乙酸雙氧鈾染色并干燥后通過TEM成像。

采用時間分辨熒光免疫分析（TRFIA）定量DLBCL細胞系和血清EVs中四跨膜蛋白CD63和CD81的表達。鏈霉親和素包被的96孔板用生物素化一抗包被，加入EV樣品孵育，然后加入銪標記的納米顆粒偶聯抗體，用板式讀數器測量熒光信號。同時，采用生物素-鏈霉親和素熒光免疫分析（BSFIA）檢測EVs中的CD9。為提高血清來源EVs的檢測靈敏度，樣品先用0.1% Triton X-100透化處理。

通過WB分析細胞系和患者血清來源EVs中表面和腔內EV相關蛋白的存在。EV樣品在4%–20%預制聚丙烯酰胺凝膠上進行非還原條件電泳，并轉印至硝酸纖維素膜。使用針對CD9、CD81、CD44、HSP70、CD19、CD20和ApoA1的一抗進行孵育，然后與熒光標記的二抗孵育，使用Odyssey CLx成像系統檢測信號。

使用ZetaView PMX-120、NanoSight Pro和NS300系統測量DLBCL細胞系和患者血清來源EVs的尺寸分布和濃度。EV樣品用過濾PBS稀釋至最佳顆粒濃度，儀器使用聚苯乙烯微珠校準，測量在受控溫度下進行，記錄視頻并使用專用軟件分析顆粒尺寸和濃度。

在Turku蛋白質組學設施進行MS分析，以表征SEC純化的細胞培養和患者血清來源EVs的蛋白質含量。采用數據非依賴性采集（DIA）LC-MS/MS方法進行定量蛋白質組學。EV樣品裂解后，蛋白質經還原、烷基化，并用胰蛋白酶消化。肽段通過Evosep One LC系統分離，并在timsTOF fleX MALDI-2質譜儀上使用dia-PASEF模式進行分析。原始數據使用Spectronaut軟件處理，使用人類UniProt數據庫進行蛋白質鑒定，并使用MaxLFQ進行無標記定量。

使用配對t檢驗、單因素方差分析和雙因素方差分析進行統計學評估。對于MS數據，進行單因素方差分析和數據歸一化。數據歸一化通過將最低強度值設為0，最高值設為100來實現。使用GraphPad Prism、Microsoft Excel和OriginLab進行統計計算和圖表生成。

TEM評估顯示，細胞培養來源的EVs呈典型的杯狀形態，而血清來源的EVs主要呈圓形且邊界更均勻。值得注意的是，DLBCL亞型間EV形態和豐度存在差異：ABC亞型（U-2， Ri）產生更小、更豐富的EVs，而GCB亞型（S-4， O-7）產生更大但數量較少的囊泡。血清來源的EVs在患者樣本間存在較大變異性。

ABC來源的EVs更小，U-2 EVs范圍為30–170 nm，Ri EVs為40–80 nm。GCB來源的EVs尺寸分布更大：S-4 EVs范圍為100–250 nm，顯著大于U-2、Ri和O-7的EVs。血清來源的EVs也表現出顯著的個體間異質性，尺寸分布各異。

NTA分析（ZetaView PMX-120）顯示，細胞系EVs的中位直徑分別為：U-2（128.5 nm）、Ri（106.5 nm）、S-4（143.9 nm）、O-7（125.6 nm）。顆粒主要范圍在≈70–340 nm之間，GCB來源的EVs顯示出更寬和更高的尺寸分布。在濃度方面，ABC細胞系Ri和U-2的平均顆粒計數分別為8.7 × 10¹⁰和7.1 × 10¹⁰顆粒/ml，高于GCB細胞系S-4（2.8 × 10¹⁰顆粒/ml）和O-7（2.0 × 10¹⁰顆粒/ml）。血清EVs明顯更小，中位直徑在97.1至107.3 nm之間，顆粒濃度在3.6 × 10¹⁰至8.3 × 10¹¹顆粒/ml之間。NTA分析與基于TEM圖像的手動測量在總體EV尺寸趨勢上一致，盡管不同技術間的平均尺寸差異很大，這凸顯了評估EV制備物尺寸的復雜性。

免疫金TEM（iEM）用于定位DLBCL細胞系和患者血清來源囊泡上的關鍵EV表面標志物（CD9和CD81）。ABC亞型細胞系（U-2和Ri）的EVs對CD9和CD81均顯示出清晰的金顆粒標記。在GCB亞型中，S-4 EVs可見但標記強度較低，而O-7 EVs顯示最弱的染色，表明表面標志物表達較低。相比之下，血清來源的EVs使用與細胞系EVs相同的染色方案未能實現功能性標記。嘗試用0.1% Triton X-100透化患者來源的EVs，但此過程導致囊泡從電鏡載網上脫落，阻礙了成功成像。這些發現凸顯了對血清來源EVs使用與細胞系來源囊泡相同的iEM實驗方案的技術限制。

使用TRFIA和BSFIA對CD9、CD81和CD63進行EV標志物的定量分析。所有測量均在來自U-2、Ri、S-4和O-7細胞系以及血清來源EVs（用于CD9）的EVs上進行，并歸一化至蛋白質濃度。

在BSFIA分析中，在所有DLBCL來源的EVs中均檢測到CD9，但表達水平不同。CD81水平在所有樣本中均顯著高于CD63，ABC型EVs（尤其是Ri）顯示出最強的表達。在GCB來源的EVs中，S-4 EVs的CD81表達水平高于O-7 EVs。與CD9和CD81相比，所有樣本中的CD63水平持續較低。綜合來看，免疫分析數據突顯了ABC亞型EVs中CD81和CD9表達升高的模式。這些發現通過外包的Leprechaun分析（Unchained Labs）得到加強，該分析采用直接芯片結合抗體捕獲CD81、CD63和CD9陽性EVs。根據該分析，所有三種四跨膜蛋白在ABC細胞EVs（Ri和U-2）中的表達量至少是GCB細胞EVs（S-4或O-7）的10倍。在血清來源的EVs中，使用相同技術分析，所有三種四跨膜蛋白在所有4個樣本中均有適度但可變的表達。相比之下，通過免疫熒光染色觀察，四跨膜蛋白CD63、CD9和CD81在所有細胞系中均等表達，ABC和GCB細胞系間的標志物表達沒有明顯差異。使用BSFIA也測量了血清來源EVs（0.1% Triton-X 100透化）中的CD9表達；在所有四個樣本中均發現CD9存在，但表達存在差異且適度。這些結果與iEM發現一起表明，免疫分析在檢測臨床血清來源EVs中的表面標志物方面可能比顯微鏡技術更敏感。

為了進一步表征細胞系來源的EVs，進行了免疫金電鏡以可視化和量化CD9和CD81的表面表達。定量分析顯示，CD9陽性EVs的總體比例在不同細胞系間存在差異，在Ri EVs中觀察到最高表達（21.0%），其次是U-2和S-4（均為15.0%），O-7最低（9.6%）。當按EV尺寸分層時，CD9在較大EVs（>100 nm）上比在較小EVs（<100 nm）上更頻繁地被檢測到。例如，在U-2來源的EVs中，CD9存在于58.0%的大型EVs中，而僅存在于5.0%的小型EVs中。這一趨勢在所有細胞系中保持一致，表明CD9在DLBCL中富集到較大EVs中存在尺寸依賴性。同樣，CD81表達在ABC亞型EVs中最高，U-2 EVs顯示61.5%的陽性，其次是Ri（40.7%）。GCB來源的EVs顯示出較低的CD81陽性率，S-4為18.3%，O-7為16.0%。與CD9類似，CD81主要富集在較大的EV群體（>100 nm）中。有趣的是，ABC亞型來源的EVs總體上表現出相對較高的CD9和CD81表達。然而，這些標志物的分布在他們之間略有不同。例如，S-4 EVs顯示出較高的CD63（基于先前結果）和CD9水平，但CD81表達相對較低。這表明囊泡標志物組成可能存在亞型特異性異質性。所有細胞系中，小型EVs（<100 nm）的數量均多于大型EVs（>100 nm），但較大的EVs持續攜帶更高比例的可檢測標志物。

這些數據展示了DLBCL來源EVs中四跨膜蛋白表達的細胞亞型（或來源）依賴性和尺寸依賴性模式。CD81和CD9在ABC細胞來源的大型EVs中的強烈富集表明，囊泡表面組成可能反映了DLBCL亞型間潛在的分子差異。

進行了基于MS的蛋白質組學表征，分析了以下樣品：（1）SEC分離的BCL EVs，（2）SEC分離的血清EVs，（3）MagNet富集的血清EVs，（4）普通血清。在所有樣品類型中，共鑒定到5269種蛋白質。MS證實了細胞系和血清EVs中均存在大量先前報道的EV相關蛋白質（例如，CD9、Alix、Hsps），其中細胞系EVs顯示出比血清來源EVs更多的蛋白質鑒定結果。SEC分離的BCL EVs產生的數量最高（3113），其次是血清富集的EVs（1563），SEC分離的血清EVs（938）和普通血清（562）。這凸顯了不同樣品基質間的效率差異，以及SEC所實現的優越富集和蛋白質組覆蓋深度。

維恩圖比較揭示了各組間蛋白質重疊和獨特性的程度。共有293種蛋白質是SEC分離的BCL EVs、SEC分離的血清EVs和MagNet富集的血清EVs所共有的。與普通血清相比，有178種蛋白質在所有含EV的餾分中一致檢測到，這表明存在一個核心的EV蛋白質組，與樣品來源無關。

為了評估EV特異性，將數據集與從Vesiclepedia和ExoCarta整理的前100個EV相關蛋白質進行了比較。這兩個數據庫中74種規范的EV蛋白質是共同的。與這74種EV蛋白質相比，在SEC分離的BCL EVs中檢測到的數量最多（73），其次是血清富集的EVs（59）、SEC分離的血清EVs（52）和普通血清（15）。這證實了EV標志物富集在來自細胞培養上清液的SEC分離囊泡中最為有效。規范的EV標志物，包括CD9、CD81、HSP70、HSP90B1、Alix和Ezrin，在EV豐富的樣品中容易檢測到，但在普通血清中基本不存在，這證實了有效的EV富集和標志物特異性。

進一步分析這74種EV標志物顯示，在四個樣品組中存在不同且重疊的表達譜。雖然15種EV標志物在所有制備物中共有，但44種在血清富集的EVs、SEC分離的血清EVs和SEC分離的BCL EVs中常見。僅有6種標志物在BCL EVs中被獨特鑒定，這表明EV蛋白質含量存在方法特異性和來源特異性差異。

熱圖分析說明了關鍵EV相關蛋白質在血清和細胞系樣品間的相對豐度差異。諸如HSP90亞型、膜聯蛋白和syntenin-1等蛋白質在細胞系來源的EVs中顯示出高表達，而血清EVs表現出更多的變異性和較低的強度，這可能反映了生物學異質性和從血清中獲得的EV產量降低。有趣的是，與B細胞淋巴瘤或惡性進展相關并在血清中發現的CD44和Gal3BP（半乳糖凝集素-3結合蛋白）的表達，在所有研究的淋巴瘤細胞系和淋巴瘤患者來源的EVs中都非常豐富。另一方面，四跨膜蛋白和熱休克蛋白的定量分析顯示，CD9在血清富集的EVs中表達更高，而CD81和HSP90B1在血清和細胞來源的EVs中均被一致檢測到。這些結果表明，常見EV標志物的表達或可及性存在差異，取決于樣品來源和富集方法。

總而言之，數據表明DIA-MS能夠實現穩健的EV蛋白質組學分析，并且SEC提供了有效的EV富集，特別是來自培養的淋巴瘤細胞。比較分析揭示了患者和細胞系來源樣品中存在不同的EV蛋白質組特征，為淋巴瘤EV研究中的生物標志物發現和機制研究提供了寶貴的見解。

通過WB分析了SEC分離的ABC型（U-2， Ri）和GCB型（S-4， O-7）細胞系EVs以及四名淋巴瘤患者（Pt#01-Pt#04）血清EVs中膜結合和內部EV標志物的表達。細胞系來源的EVs通常不需要透化來提高規范標志物的表達，并且四跨膜蛋白CD9和CD81在非透化和Triton-X-100透化的樣品中均能被同等檢測到。有趣的是，正如免疫分析和iEM所示，ABC型U-2和Ri EVs顯示出比GCB型S-4和O-7相對更高的四跨膜蛋白表達。另一方面，在血清來源的EVs中，不進行透化則無法檢測到四跨膜蛋白，透化處理將CD9信號強度提高到可檢測水平：即使經過透化步驟，CD81信號在血清EV樣品中也幾乎檢測不到。類似地，Hsp70和CD44信號在沒有樣品透化步驟的印跡中幾乎檢測不到。

重要的是，B細胞特異性標志物CD19和CD20在細胞系EVs中清晰可見，并且透化后CD19表達在血清來源的EVs中也變得更加顯著。此外，在細胞系EVs中，在報道的約95 kDa大小處檢測到顯著的CD19表達。有趣的是，患者血清EVs主要表達一個顯著的約200 kDa大小的CD19，反映了血清來源EVs中可能存在的二聚體形成。這一假設通過蛋白質印跡實驗得到加強，其中血清來源的樣品用或不用還原劑β-巰基乙醇處理以斷裂蛋白質間的硫橋：這種處理將CD19信號改變為報道的約95 kDa大小。這引出了一個有趣的問題：與細胞系來源的EVs相比，CD19在血清EVs中分泌或表達的形式。CD20在DLBCL細胞EVs中的表達先前已被證實，并且發現它在U-2和S-4細胞系EVs中表達更顯著。然而，在患者血清EVs中，無論使用何種透化步驟，在所評估的四名患者樣本中均未檢測到CD20的表達。

另一個有趣的標志物，也與BCL發病機制相關的跨膜受體CD44，在此進行了檢查。注意到細胞系和血清EVs在沒有透化的情況下均顯示出微弱或無法檢測到的信號，表明其豐度低或表位被屏蔽。有趣的是，腔內標志物HSP70在非透化條件下在細胞系EVs和血清EVs中幾乎檢測不到，而透化步驟使得在血清EVs中能夠強檢測。

WB結果驗證了細胞系和患者來源樣品中表面和腔內EV標志物的存在。透化前后標志物檢測的差異性強調了這一步驟的重要性，特別是在研究臨床樣本時，更復雜的EV表面可能會掩蓋抗原表位。

EVs正在成為血液惡性腫瘤中有前景的生物標志物，然而它們在淋巴瘤中的臨床應用仍然受到亞型特異性表征以及在血清等復雜體液中檢測挑戰的限制。在本研究中，應用了一個多模式的EV表征流程，結合SEC分離、TEM + iEM、免疫分析、WB和MS，平行研究了兩種主要DLBCL亞型ABC和GCB以及一個有限的、概念驗證隊列的淋巴瘤患者來源EVs的特征。研究結果表明，來自DLBCL細胞系的EVs表現出獨特的形態學和分子特征。值得注意的是，觀察到ABC型細胞釋放更小的EVs，其CD81和CD9的富集度顯著高于GCB型，后者顯示出相對較大的EVs和較低的四跨膜蛋白標志物表達。這些差異與MS、TRFIA和BSFIA免疫分析、WB和iEM分析結果一致。

有趣的是，CD81和CD9都優先富集在較大的EVs（>100 nm）中，這表明標志物分布不僅可能與細胞起源有關，還與EV亞群有關。這些發現擴展了先前關于癌癥來源EVs中四跨膜蛋白異質性的報道，并表明四跨膜蛋白，特別是CD81，可能作為未來液體活檢應用中DLBCL亞型分層的一個潛在生物標志物。然而，本研究未在此研究患者來源材料中的表達，關于四跨膜蛋白在ABC亞型中富集表達的發現需要在由ABC、GCB和健康供體血清或血漿樣本組成的隊列中進行擴展和確認。

除了細胞系來源的EVs，還研究了從淋巴瘤患者血清中分離的EVs，以探究在復雜的生物體液中檢測B細胞起源標志物的可能性，并比較不同樣品類型間的方法學特征。與細胞系樣品相比，來自四種不同類型淋巴瘤診斷的血清EVs在尺寸和形態外觀上如預期般顯示出異質性。應用了相同的實驗方案評估樣品，MS分析顯示幾種標志物在細胞系和血清EVs中均被鑒定。然而，驗證實驗（如ELISA和WB）不能直接應用于血清EVs，而需要樣品透化等進一步優化。通過透化步驟，在MS中檢測到的分子（以及一些未檢測到的）可以在免疫分析和WB分析中成功檢測。然而，這種優化并未促進iEM中的標志物檢測。嘗試透化EVs以暴露內部表位損害了EVs在載網上的結合，進一步凸顯了生物流體中EV成像的技術挑戰以及進一步優化EM輔助標志物檢測的必要性。盡管如此，MS和WB分析均證實了患者來源樣品中存在關鍵的EV標志物，包括CD9、CD81和HSP70，強調了結合正交技術進行全面EV表征的實用性。

除了診斷潛力外，觀察到的EV形態和標志物組成的差異也可能反映了DLBCL亞型間EV釋放途徑的潛在生物學差異。ABC型DLBCL與更具侵襲性的臨床病程和增加的代謝活性相關，這可能有助于在這些細胞系中觀察到的總EV釋放增加。此外，ABC細胞EVs中較高的四跨膜蛋白表達以及CD81和CD9在較大EVs中基于尺寸的富集，提示了亞細胞起源或釋放到EVs中的可能差異；然而，這方面未在本項目中進行研究。有趣的是，即使EVs中的相對四跨膜蛋白表達存在顯著差異，當通過免疫熒光染色觀察時，所有DLBCL細胞系在細胞群體內均表達了相當的CD81、CD9和CD63。通過非侵入性EV表征區分DLBCL亞型的能力為疾病監測開辟了潛在途徑，特別是在組織活檢難以獲取或高風險的情況下。

研究結果也為血液惡性腫瘤EV研究的方法學考量提供了寶貴見解。基于SEC的分離為下游分析提供了足夠的EV純度和產量，這反映在通過DIA-MS鑒定出的高數量EV相關蛋白質以及各分析中一致的四跨膜蛋白檢測上。每種表征方法都表現出不同的優勢和局限性。值得注意的是，根據Wu等人的方案，從血清中自動磁富集脂質顆粒是有效的，可以作為EV蛋白質組分析的一種更省力的方法。對于特定標志物的靶向驗證，注意到即使MS未檢測到某些標志物（例如B細胞標志物CD19），當通過WB分析時，該蛋白質存在于所有EVs中。這對于某些表面錨定標志物尤其常見。免疫金TEM成功區分了細胞系EVs中的標志物表達，但在血清來源EVs中受阻，可能是由于蛋白質冠，這是生物流體來源EV分析中反復出現的障礙。這些技術發現支持了最近關于方法標準化和使用互補方法驗證EV內容和來源的呼吁。

與DLBCL亞型特異性相關的有趣發現出現在細胞系EVs的MS分析中：其中之一是抗凋亡調節因子BCL-2，據報道與不良預后相關，并在DLBCL的ABC亞型中高表達。BCL-2僅在本數據集的ABC EVs中檢測到。另一個有趣的蛋白質命