《Aquaculture Science and Management》：Evaluation of different stocking densities on growth parameters, digestive enzymes, hemato-immunological and stress responses of Cirrhinus reba (Hamilton, 1822)
引言
水產養殖業在全球改善營養安全和減貧方面發揮著重要作用，同時提升了貧困農民的社會經濟地位并促進了該行業的就業。鯉科魚類，特別是鯉魚，構成了印度水產養殖的支柱，貢獻了總產量的85%。將諸如巴塔魚、潘蒂烏斯魚、彭巴魚等小型鯉科魚類與印度主要鯉魚一同引入養殖系統，可以豐富傳統的水產養殖模式。其中，雷巴野鯪（Cirrhinus reba）是一種分布于印度次大陸的重要食用魚。它被認為是最重要的本土小型鯉科魚類之一。雷巴魚是一種生態友好型魚類，也是動物源性營養素的重要來源。由于其誘人的大小、高營養價值、美味的口感以及魚刺較少，雷巴魚深受人們喜愛。在印度北部和東北部，雷巴魚非常受歡迎，通常整條食用，市場需求和價格較高（200-250印度盧比/公斤），是一種適合水產養殖的物種。然而，由于過度捕撈和各種人類活動導致其自然產卵和生長棲息地的喪失，野生種群正在迅速減少。
放養密度是決定魚類養殖系統經濟可行性的關鍵因素，因為它直接影響養殖魚類的生長、存活和凈產量。魚類密度是指單位養殖水體體積中放養的魚的數量。商業水產養殖中常采用高密度養殖以獲得更高的產量和效益。假設養殖環境中的擁擠是影響魚類生理機能，進而影響其健康狀況的最重要脅迫因素之一。先前的研究已探討了不同放養密度對多種魚類生長性能和存活的影響，例如彭巴魚（Osteobrama belangeri）、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）、馬賈拉雅普通鯉魚（Cyprinus carpio）、卡特拉鲃（Catla catla）和露斯塔野鯪（Labeo rohita）等。然而，雷巴魚的半精養商業化生產尚未建立。因此，為滿足對高質量動物蛋白的需求，需要對重要物種采用半精養實踐。本研究旨在通過優化雷巴魚在室外水泥池半精養系統中45天魚種生產的放養密度，來開發相應的培育技術。
材料與方法
倫理聲明
本研究的倫理批準、樣本采集和維護均嚴格遵守印度特里普拉中央農業大學漁業學院動物倫理委員會的倫理標準建議。
實驗地點與設計
本研究在印度特里普拉萊姆布切拉的漁業學院進行。實驗采用完全隨機設計（CRD），使用容積為20立方米（5米×4米×1米）的水泥池。將魚苗分為三個處理組，每組設三個重復，分別為SD1（10尾/立方米）、SD2（20尾/立方米）和SD3（30尾/立方米），養殖45天。在設計本次研究的放養密度之前，先進行了為期45天的預實驗，測試了五種不同的放養密度，并根據結果排除了不顯著的密度。
飼料制備與近似成分
使用選定原料配制了等氮（30%粗蛋白）飼料。所有原料均購自特里普拉中央農業大學漁業學院的飼料廠。將原料在容器中充分混合形成均勻混合物，并制成面團。面團在高壓滅菌鍋中蒸煮20分鐘以使淀粉充分糊化，然后冷卻。隨后添加維生素-礦物質混合物等微量營養素。通過孔徑為1毫米的制粒機將面團壓制成均勻顆粒。顆粒在45°C的熱風烘箱中干燥12小時，然后裝入密封容器中。混合物隨后儲存在干燥陰涼處以供后續投喂實驗魚使用。
飼料的近似成分通過標準方法進行分析。飼料配方和近似成分如表1所示。水分含量通過在105°C熱風烘箱中干燥樣品至恒重進行分析。粗蛋白（CP）含量通過標準設備（TecatorTM消化器和KjeltecTM8400分析儀單元，FOSS）測定，粗脂肪（CL）含量通過索氏脂肪提取器（Labtec ST310溶劑，FOSS）估算。粗纖維（CF）含量通過纖維分析儀（fibraplus–FES 06 AS）測定，總灰分（TA）含量通過在550°C的馬弗爐中灼燒5小時測定。無氮浸出物（NFE）通過扣除法用以下公式計算：
NFE = 100 ? (%CP + %EE + %CF + %TA)
實驗設置與魚類管理
水泥池鋪設了8厘米厚的底泥，并在實驗開始前進行干燥和充分曝曬。整個池塘按照標準管理實踐進行準備。池塘首先清潔，按300公斤/公頃（每池100克CaO）的比例施用石灰，然后注入地下水，保持水位在90厘米。石灰處理后一周，分兩次施用浸泡過的芥菜籽餅進行施肥，每池用量為750克。
放養操作遵循鯉魚養殖操作規程進行。魚苗取自特里普拉中央農業大學漁業學院的養殖場。魚苗在早晨進行適應和存放。15日齡雷巴魚苗的初始平均長度和體重分別為3.81 ± 0.26厘米和0.59 ± 0.09克。使用顆粒飼料（粒徑0.6毫米）投喂，初始投喂率為魚體重的6%（每天兩次；上午10:00和下午04:00），每兩周調整一次，后續調整至體重的4%。為防止鳥類捕食，池塘用尼龍網覆蓋。
水質參數
在實驗期間監測水質參數。使用攝氏溫度計記錄水溫。使用光學溶解氧探頭（ProODOTM, YSI Environmental）測量溶解氧，使用數字pH計（HI 991,001, HANNA）記錄pH值。總堿度、硬度、游離二氧化碳、銨態氮（NH4+-N）、亞硝態氮（NO2-N）和硝態氮（NO3-N）通過標準滴定法測定。凈初級生產力（NPP）和總初級生產力（GPP）（毫克碳/平方米/小時）通過標準方法（即明暗瓶法）在特定時間間隔測定。
生長性能
生長性能指標包括平均終末長度、平均終末體重、特定生長率（SGR）、日均增重（MDWG）和存活率（SR），通過以下公式計算：
平均終末長度 = 終末長度 - 初始長度
平均終末體重 = 終末體重 - 初始體重
SGR（%/天） = （終末體重對數 - 初始體重對數）/ 養殖天數 × 100
MDWG（%） = （終末體重 – 初始體重）/ 時間（天） × 100
存活率（%） = （最終存活尾數 / 初始放養尾數） × 100
飼料利用參數，即表觀飼料轉化率（AFCR）和表觀蛋白質效率比（APER），通過以下公式計算：
AFCR = 飼料消耗量（克）/ 增重（克）
APER = 活體增重（克）/ 蛋白質消耗量（克）
魚類健康參數
肝體指數（HSI）、肥滿度（K）和相對豐滿度（RF）被視為魚類健康參數，通過以下公式計算：
HSI = （肝臟重量（克）/ 魚總重（克）） × 100
K = （體重（克） × 100）/ 體長（厘米）3
RF = （體重 - 內臟重量）/ 體長3× 100
消化酶活性
樣品制備
實驗結束后，稱量魚種以計算生長指數。從每個池中隨機撈取五尾魚，用丁香酚（50微升/升）麻醉后處死，采集腸道用于消化酶分析。將腸道組織稱重，在冰冷的250毫摩爾蔗糖溶液中勻漿并離心（5000轉/分，15分鐘）。用移液器將上清液收集到Eppendorf管中，并儲存于-20°C。
腸道中的蛋白質含量通過分光光度法進行定量。測定的組織蛋白質含量用于估算消化酶的比活性。
消化酶活性
通過酪蛋白消化法測定腸道中蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性。
血液學測定
血液采集
從每個池中隨機撈取魚，用丁香酚（50微升/升）麻醉。從尾靜脈采血。使用預先用2.7% EDTA鹽溶液沖洗過的1毫升注射器和26號針頭，立即將血液轉移至涂有EDTA（作為抗凝劑）的干燥Eppendorf管中，充分搖勻以防止溶血，并置于4°C保存。另從每個池中采集兩到三尾魚用于收集應激反應參數的血液。
血液參數
血液參數包括血紅蛋白（Hb）、紅細胞（RBC）、紅細胞壓積（Hct）、白細胞（WBC）及其衍生指標平均紅細胞體積（MCV）、平均紅細胞血紅蛋白（MCH）和平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC），均通過血液分析儀（Exigo）進行分析。
血糖和皮質醇被視為應激反應參數。血糖含量使用美國ERBA診斷公司的標準血糖儀進行分析。皮質醇使用經過驗證的放射免疫分析（ELISA LDN-MS E-5000）試劑盒（購自孟買Diagnostic Systems Laboratories）進行估算。該程序遵循酶免疫測定測試的基本原理，即未標記抗原和酶標記抗原競爭固定數量的抗體結合位點。與抗體結合的酶標記抗原的量與存在的未標記分析物的濃度成反比。通過傾析和洗滌孔板去除未結合的物質。血清皮質醇以納克/分升表示。
統計分析
數據通過單因素方差分析（ANOVA）進行統計分析，并使用SPSS 22.0版軟件，通過Duncan多重范圍檢驗在5%水平上解釋數據，以確定均值之間的顯著性差異。數據以平均值 ± 標準誤（SE）表示。
結果
水質參數
各實驗組水質理化參數的范圍如表2所示。水溫（°C）、pH、溶解氧（DO，毫克/升）、總堿度（毫克/升）、二氧化碳（CO2，毫克/升）、硬度（毫克/升）、銨態氮（NH4+-N，毫克/升）、亞硝態氮（NO2-N，毫克/升）、硝態氮（NO3-N，毫克/升）、磷酸鹽磷（PO4-P，毫克/升）的范圍分別為28.43-33.10、7.89-8.17、7.20–10.0、54.00–73.33、0.00–4.99、43.33–62.00、0.15–0.43、0.07–0.24、0.18–0.18、0.05–0.62。凈初級生產力（NPP）和總初級生產力（GPP）（毫克碳/平方米/小時）在各實驗組間未受顯著影響（p > 0.05），其值列于表3。
生長性能
生長性能指數如表4所示。在SD1組（放養密度10尾/立方米）中觀察到顯著提高（p < 0.05）的生長性能，其特定生長率（SGR，5.38%/天）和日均增重（MDWG，13.40%）、存活率（88.33%）、表觀飼料轉化率（AFCR，1.05）和表觀蛋白質效率比（APER，1.92）均優于SD2和SD3組。肥滿度、肝體指數（HSI）和相對豐滿度在各組間未受顯著影響（p > 0.05），具體數值見表4。
消化酶活性
雷巴魚腸道消化酶（蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶）的活性如圖1所示。蛋白酶活性在SD1組（1.43單位/毫克蛋白質/分鐘）顯著高于（p < 0.05）其他組，在SD3組最低（0.91單位/毫克蛋白質/分鐘）。脂肪酶活性在SD1和SD2組之間無顯著差異，但SD3組的活性顯著較低（p < 0.05）。淀粉酶活性在各實驗組間無顯著差異。
血液學測定
血液免疫學參數的值如表5所示。血紅蛋白（Hb）、紅細胞（RBC）、紅細胞壓積（Hct）、平均紅細胞體積（MCV）、平均紅細胞血紅蛋白（MCH）、平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）和白細胞（WBC）計數等參數在各實驗組之間均無顯著差異（p > 0.05）。
應激反應參數血糖和皮質醇受不同放養密度的顯著影響，如圖2所示。血糖的最低值出現在SD1組（46.96毫克/分升），其次是SD2組（50.20毫克/分升）和SD3組（56.68毫克/分升）。同樣，皮質醇值也在SD1組最低（310.93納克/分升），其次是SD2組（348.24納克/分升）和SD3組（381.34納克/分升）。
討論
養殖環境的理化參數在魚類天然餌料生物的生產以及維持健康水環境方面起著重要作用。魚類的生長性能、飼料效率和飼料消耗通常依賴于水質和其他生態因素。
水質參數
本實驗在適宜的水溫（28.43–33.10 °C）、pH（7.65–8.17）和溶解氧濃度（7.20–10.00毫克/升）下進行。此外，整個實驗期間的所有水質參數均在鯉魚養殖的允許范圍內。所有池塘中的初級生產力（NPP和GPP）也被發現對魚類有利，這得到了先前說明不同鯉魚養殖中水生產力的報告的支持。
生長性能
養殖環境中的放養密度是一個關鍵因素，也是水產養殖實踐中公認的因素。在較低放養密度（10尾/立方米）的SD1組中觀察到優越的生長性能指數（SGR、MDWG、存活率、AFCR和APER），這可能歸因于相較于其他組，其在飼料和空間上的競爭更少或應激水平更低。本研究證實了先前發表的研究報告，這些報告揭示了在各種養殖環境中改善的生長性能。
消化酶活性
營養物質被運送到動物組織中，融入細胞代謝機制，并為生長和其他活動提供能量。蛋白酶比活性在SD1組顯著高于（p < 0.05）SD2和SD3組，而脂肪酶比活性在SD1和SD2組顯著高于SD3組，這表明在本研究中，較低的雷巴魚放養密度可能增加了營養物質（蛋白質和脂類）的利用和同化。這可能是由于食物和空間競爭減少，導致SD1組的生長優于SD2和SD3組。本研究得到了先前研究結果的支持，這些研究表明較高的放養密度會降低消化酶的比活性。
血液學測定
相對較高的放養密度會導致擁擠脅迫，魚類在養殖環境中會發生許多生理變化。在應激源中，初級和次級應激源負責代謝、血液學和結構變化，而三級應激源則影響整個動物。通常，血細胞數量反映了養殖動物的狀況。本研究中，血細胞計數（Hb、Hct、MCV、MCH、MCHC和WBC）均在正常范圍內，且組間無顯著差異（p > 0.05），表明放養密度未影響血液參數，這可能是因為放養密度對血液參數的影響較小，這與Rafatnezhad等人的觀察結果相似。
多種因素經常影響水產養殖系統中的魚類應激，例如環境溫度、放養密度、操作、水體理化參數、運輸和分選，這些都會對魚類的生長和健康產生負面影響。在存在應激的情況下，動物的下丘腦-垂體-腎間組織（HPI）軸受到刺激，導致兒茶酚胺和皮質類固醇濃度升高，從而引發高血糖。皮質醇水平被認為是應激的主要反應，其升高是因為應激會引發高血糖并削弱魚類的免疫系統。血糖水平被認為是應激的次級反應。血糖濃度是評估各種應激源（包括物理因素和污染物）影響的有效指標。養殖環境中相對較高的放養率會發生競爭性相互作用，而擁擠脅迫可能是在相對較低放養率（SD1）下葡萄糖和皮質醇水平降低的原因。類似地，在空間更充足、飼料更豐富的適宜環境中飼養的魚類，在SD1組表現出較低的應激和改善的免疫反應。相比之下，血糖和皮質醇升高可能是雷巴魚在相對較高放養密度（SD2和SD3）下面臨較高水平擁擠脅迫而導致生長減緩的原因。本研究得到了相關發現的支持，即較高的放養率會增加各種鯉魚和其他魚類物種的葡萄糖和皮質醇水平。
結論
雷巴野鯪（C. reba）可以作為混養和多樣化淡水水產養殖的候選物種。本研究結果表明，在所研究的體重范圍內，10尾/立方米的放養密度對于提高雷巴魚的生長性能和消化酶活性、減少擁擠脅迫而言是最佳的。相反，相對較高的放養密度（>10尾/立方米）會抑制生長性能并增加擁擠脅迫。然而，雷巴魚的培育實踐需要在不同溫度條件和不同養殖系統中進行大量研究。本研究將為在不同條件下優化這種重要經濟小型鯉科魚類在土池中的放養密度提供基線依據。
