《The Plant Genome》：Quick creation and mapping of EMS-induced maize kernel mutants identifies classical gene ZmBT1 and novel gene ZmTOP6A
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本研究通過EMS（乙基甲磺酸）花粉誘變技術在五個玉米自交系中快速創制了超過400個獨立籽粒突變體，并利用BSA（集群分離分析法）結合全基因組測序成功定位了兩個代表性突變體的關鍵基因：導致籽粒皺縮的經典ADP-葡萄糖轉運蛋白基因ZmBT1和引起籽粒變小的新型DNA拓撲異構酶VI A亞基基因ZmTOP6A。研究通過等位驗證、蛋白保守性、表達模式及亞細胞定位分析，確認了這兩個基因的功能，展現了EMS誘變與BSA聯用策略在挖掘玉米籽粒發育基因、解析遺傳網絡及驅動分子育種方面的巨大潛力與高效性。
1 引言
玉米(Zea mays L.)是全球主要谷類作物，也是研究籽粒（種子）發育的正向與反向遺傳學關鍵模式生物。傳統定位克隆方法耗時費力，而基于參考基因組和測序技術進步的集群分離分析（BSA）與高通量測序結合，顯著加速了突變基因的鑒定。本研究旨在利用EMS花粉誘變技術創制玉米籽粒突變體，并運用BSA與全基因組測序（WGS）策略快速鑒定相關基因，以深化對籽粒發育分子機制的理解。
2 材料與方法
研究使用了五個花期相近的玉米自交系：B73、MO17、PH6WC、PH4CV和W9816。采用改良的EMS花粉誘變法進行誘變處理，通過自交獲得M2代并篩選籽粒性狀分離的穗。對每個突變體構建野生型池（WP）和突變型池（MP），提取DNA進行全基因組測序。利用BWA等工具將測序數據比對至玉米參考基因組，通過變異檢測和注釋，采用改進的“MutMap”方法進行關聯定位。計算SNP-index（突變型等位基因頻率）和SNP-index.DIV值，篩選候選區域和因果突變。此外，研究還進行了基因保守性分析、表達模式分析以及利用玉米原生質體進行了亞細胞定位實驗。
3 結果
3.1 通過EMS花粉誘變快速創制玉米籽粒突變體
五個玉米自交系經EMS誘變后表現出不同的處理效果。B73和MO17受影響最嚴重，而W9816影響最小。最終獲得了總計421個玉米籽粒突變體（M2代），來自不同遺傳背景。突變體表現出廣泛的表型變異，包括胚、胚乳和其他籽粒結構的各種缺陷。大部分突變體遵循野生型與突變型籽粒3:1的分離比，表明表型由單基因的隱性等位基因控制。
3.2 皺縮籽粒突變體(B73_KM#4)的表型觀察與基因定位
B73_KM#4（bt1-1）表現出典型的籽粒皺縮/塌陷表型，胚乳幾乎缺失，籽粒重量約為野生型的一半。通過BSA策略結合WGS進行基因定位，測序數據分析揭示了一個錯義突變（c.464C > T|p.P155L）位于基因Zm00001eb235570（brittle endosperm 1, ZmBT1）上，該基因編碼ADP-葡萄糖轉運蛋白，與突變表型相關。
等位驗證進一步確認了ZmBT1是導致皺縮表型的關鍵基因。另外兩個皺縮籽粒突變體（bt1-2和bt1-3）也被鑒定出存在ZmBT1基因的無義突變。雜合子間的雜交均表現出相似的野生型與皺縮籽粒分離模式。
3.3 ZmBT1的保守性分析、基因表達模式及亞細胞定位
保守性分析表明，ZmBT1屬于“腺嘌呤核苷酸轉運蛋白BT1”家族，在禾本科（Poales）物種中形成一個特異性聚類。表達模式分析顯示，ZmBT1在發育的胚乳中特異性高表達。亞細胞定位實驗發現，ZmBT1及其P155L突變體形式定位于葉綠體（在胚乳細胞中則為淀粉體），而兩個截短突變體（W186和Q118）則呈現點狀分布模式。
3.4 新型小籽粒突變體(B73_KM#44)的表型觀察與基因定位
B73_KM#44是一個新發現的小籽粒（或缺陷型）突變體，其典型的角質胚乳缺失，籽粒重量比野生型低約20%，且不能萌發。BSA基因定位將候選區域鎖定在1號染色體起始位置附近，并鑒定出兩個候選突變。其中，基因Zm00001eb013040（DNA topoisomerase VI A subunit, ZmTOP6A）的起始密碼子丟失突變（c.3G > A|p.M1?）被認為是導致小籽粒表型的最可能原因。
從maizeEMSDB獲得的另一個EMS誘導突變體（top6a-2）攜帶ZmTOP6A的無義突變（c.1231C > T|p.Q411*）。等位測試證實了ZmTOP6A的功能缺失突變是導致籽粒變小、角質胚乳缺失和種子致死表型的原因。
3.5 ZmTOP6A的保守性分析、基因表達模式及亞細胞定位
ZmTOP6A屬于“拓撲異構酶”基因家族。保守性分析顯示，ZmTOP6A與其在禾本科和擬南芥中的近緣同源物形成一個獨立的聚類。表達譜分析表明ZmTOP6A無明顯組織特異性，與其致死表型一致。亞細胞定位實驗證實ZmTOP6A及其突變形式均定位于細胞核。
4 討論
4.1 利用EMS花粉誘變快速創制玉米籽粒突變體
本研究證明了利用EMS花粉誘變產生玉米籽粒突變體的高效性。相較于經典自交系（B73, MO17），三個現代商業自交系（PH6WC, PH4CV, W9816）在產生籽粒突變體方面效率更高。在兩個生長季內，研究成功獲得了約400個獨立籽粒突變體，覆蓋了廣泛的表型變異。
4.2 結合EMS誘變與BSA進行基因定位的優勢
EMS誘變在全基因組范圍內產生大量隨機分布的SNPs，結合BSA和WGS可高效定位突變基因，無需與不同生態型雜交，避免了雜種優勢等干擾。這種策略為快速鑒定玉米籽粒發育相關基因提供了有力工具。
4.3 ZmBT1參與玉米儲藏淀粉的生物合成
ZmBT1被確認為導致皺縮籽粒表型的因果基因。作為ADP-葡萄糖轉運蛋白，ZmBT1在禾本科物種胚乳淀粉合成中起著關鍵作用。其功能缺失會導致淀粉合成受阻，游離糖積累，最終形成皺縮籽粒表型。ZmBT1在禾本科中特異存在，可能在其進化分化及作為主糧作物的高效淀粉合成能力中扮演了關鍵角色。
4.4 ZmTOP6A參與玉米籽粒發育
ZmTOP6A被鑒定為導致小籽粒和致死表型的新基因。它編碼DNA拓撲異構酶VI（Topo VI）的A亞基，該酶復合物對管理DNA拓撲結構至關重要。擬南芥和水稻中的top6a突變體也表現出嚴重的發育缺陷，證實了Topo VI復合物在植物生長發育中的核心作用。玉米top6a突變體表現出異常的籽粒結構和致死性，凸顯了進一步研究其背后機制的必要性。
