《BMC Genomics》：Sensitive, flexible, and affordable serum RNA sequencing for pathogen detection on the Oxford Nanopore platform
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這篇綜述中心思想在于，針對宏基因組測序在病原體檢測中因宿主核酸豐度過高而導致靈敏度低的核心問題，提出并優化了一種結合序列非依賴性單引物擴增（SISPA）與雜交法去除高豐度序列（DASH）的低成本方法。該方法可在牛津納米孔（ONT）平臺上實現血清樣本中微生物RNA的PCR級別靈敏度檢測，顯著優于現有商業宿主去除方案，為資源有限地區的人畜共患病監測提供了高效、靈活且經濟的解決方案。
背景
病原體測序已成為公共衛生監測和疾病控制的基石。傳統的靶向方法（如PCR擴增子測序）盡管靈敏，但需預知病原體信息，且無法有效檢測共感染或新發病原體。宏基因組測序作為非靶向方法，能克服這些局限，但其在臨床樣本中的應用面臨一個主要挑戰：宿主核酸的過度存在會嚴重降低病原體檢測的靈敏度。商業宿主去除試劑盒通常價格昂貴且僅限于特定物種，阻礙了其在人畜共患病負擔最重的資源有限地區的應用。
材料與方法
研究旨在優化并整合SISPA與DASH技術，建立一種適用于牛津納米孔平臺的低成本宏基因組方案。首先，使用人血清樣本，并摻入已知濃度的病毒培養上清液或臨床樣本中的病毒進行評估。DASH（雜交法去除高豐度序列）是一種基于CRISPR/Cas9的宿主去除方法，通過設計針對人源高豐度RNA（如核糖體RNA (rRNA)、線粒體基因ATP6、ND4等）的引導RNA (sgRNA)，引導Cas9核酸酶對其進行切割去除。研究中重新設計了sgRNA，以避免對已知病毒（噬菌體除外）的脫靶效應，并評估了對血清中常見細胞病原體（細菌、真菌等）16S/18S rRNA的可能脫靶切割。樣本制備流程包括：從200 μL摻毒血清中提取核酸，經TURBO DNase處理去除DNA，隨后進行RNA變性、逆轉錄（RT）、第二鏈合成（使用Klenow片段 (3′?5′ exo-)）、DASH宿主去除、PCR擴增（采用帶有牛津納米孔測序接頭的自定義條形碼引物，即PCR條形碼法）、文庫構建，最后在R10.4.1流通池上進行24-48小時的ONT測序。數據處理包括堿基識別、質量過濾、比對及深度分析。
結果
- 1.
DASH設計及其表現：重新設計的DASH sgRNA面板有效針對人源rRNA和線粒體轉錄本，同時避免了病毒庫中的脫靶。與商業試劑（如Qiagen的FastSelect -rRNA Reagent）相比，DASH在去除宿主RNA方面表現更優，能將rRNA水平降至1%或更低，從而顯著提高病毒（如海豹瘟病毒 (PDV)）的檢測信號。研究還發現，單獨的DASH效果不佳，必須與TURBO DNase聯用才能實現最佳病毒檢測靈敏度，這表明血清中存在大量非靶向的、低豐度的宿主DNA。
- 2.
提取前核酸酶處理的局限性：與DASH+TURBO DNase聯用相比，提取前使用核酸酶（Benzonase和微球菌核酸酶）處理不僅對宿主去除效果有限（尤其是對線粒體RNA），還可能降解臨床樣本中未受保護的病毒RNA（如登革熱病毒 (DENV)），導致檢測靈敏度大幅下降（Ct值增加可達Δ14.5）。高速離心（15,000 g）可部分去除與線粒體相關的16S rRNA。
- 3.
逆轉錄前后溫度的關鍵影響：研究發現，為檢測雙鏈RNA (dsRNA) 病毒（如輪狀病毒、正呼腸孤病毒），必須在逆轉錄前引入95°C的高溫變性步驟，這可使檢測靈敏度提高數百倍。此外，逆轉錄后的溫度（即酶失活溫度）對病毒檢測和宿主去除也有顯著影響，95°C的變性效果優于85°C。結合使用耐熱RNase H來降解逆轉錄雜交體中的RNA，能獲得更優且與GC含量無關的性能。
- 4.
PCR條形碼 vs. 連接條形碼：與傳統的連接后加條形碼方法相比，在SISPA PCR過程中通過引物引入自定義條形碼（PCR條形碼法），雖然PCR產量降低約5倍，但能獲得更長的病毒序列讀長、減少實驗內污染風險，并對某些病毒和宿主轉錄本的檢測產生偏向性（傾向于保留更長的分子）。
- 5.
DASH方案的優化：研究表明，在第二鏈合成反應后不進行磁珠清洗，直接加入白蛋白緩沖液進行DASH反應（直接DASH）是可行的，對病毒檢測靈敏度影響不大，但會輕微降低對rRNA的去除效率。通過增加Cas9濃度（3倍）和縮小Klenow反應體積（至30 μL），可以減輕這種效率損失。省略蛋白酶K對Cas9的失活步驟則不推薦，因其會負面影響去除效率、讀長和部分非去除宿主轉錄本的檢測。
- 6.
降低檢測成本的嘗試：研究評估了多種更經濟的試劑替代方案，結果支持用Maxima H Minus替代Superscript IV作為逆轉錄酶，用Klenow Fragment (3′?5′ exo-)替代Sequenase 2.0進行第二鏈合成，用TaKaRa LA聚合酶替代AccuTaq LA進行PCR。此外，使用Macherey Nagel的NucleoSpin病毒試劑盒提取RNA，在調整裂解液和乙醇用量后，其性能與更昂貴的Qiagen試劑盒相當甚至更優。
- 7.
SISPA 2.0協議的性能基準測試：基于上述優化，形成了新的SISPA 2.0協議。成本分析顯示，處理24個樣本/流通池時，SISPA 2.0的成本（59歐元/樣本）比原始SISPA結合FastSelect的方案（146歐元/樣本）低2.5倍。靈敏度測試表明，在約0.6 Gb/樣本的測序深度下，SISPA 2.0可穩定檢測到低至100拷貝/mL的HIV，并能從5000拷貝/mL的樣本中獲得近全基因組覆蓋（深度≥20×）。其靈敏度分別比原始SISPA（無論是否使用FastSelect）高約32倍和7.7倍，比另一種常用方法SMART-9N結合FastSelect高2.7倍。
討論
本研究成功將DASH整合到SISPA工作流中，創建了SISPA 2.0協議。該協議不僅靈敏度顯著高于現有商業宿主去除方法，而且成本大幅降低，并具有高度的物種適應性。DASH相比提取前核酸酶處理更可靠、有效。研究強調了逆轉錄前后高溫步驟對dsRNA病毒檢測和整體靈敏度的重要性。采用PCR條形碼法有助于減少污染并獲得更長讀長。盡管通過降低磁珠比例可實現一定程度的病毒富集，但不建議在未知病原體的宏基因組學中常規使用，以免丟失小病毒或片段。協議簡化（如直接DASH）和成本控制（更換試劑）的嘗試取得了積極成果。最終，SISPA 2.0展現出了與PCR相當的檢測靈敏度，是一種真正非靶向的、適用于新病毒發現的宏基因組方法，尤其適合在全球范圍內，特別是資源有限地區，用于人類病原體診斷和人畜共患病研究。研究的局限性包括未能測試所有修改組合的相互作用、DASH面板最初并非為細胞病原體診斷優化，以及仍需進行正式的臨床驗證。
結論
本研究提出的宏基因組方法，能夠以PCR級別的靈敏度檢測人血清樣本中的微生物RNA，并且可以通過內部設計sgRNA，適配任何物種和樣本類型。由于其低成本、高靈敏度和靈活性，該技術有潛力在全球范圍內廣泛應用于人類病原體診斷和人畜共患病研究領域。
