《Microbiology Resource Announcements》：Seven genome sequences of bacterial environmental isolates from the western coast of the Greenland Ice Sheet
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七個格陵蘭冰蓋西海岸分離株的基因組測序揭示其作為極端微生物群落的生態(tài)角色及潛在生物技術(shù)應(yīng)用價值。樣本經(jīng)CTAB法提取DNA，采用Illumina NovaSeq測序結(jié)合PacBio HGAP長讀長測序完成組裝，基因組完整性達98.74%-100%。
摘要
我們報告了來自格陵蘭冰蓋西海岸的7種細菌分離株的基因組序列。冰蓋邊緣的表層冰主要由微生物組成。隨著冰蓋的融化，了解這種新型極端微生物群的生態(tài)作用和生物技術(shù)潛力變得非常重要。
公告
了解來自極端環(huán)境（如格陵蘭冰蓋）的細菌的基因組潛力，有助于發(fā)現(xiàn)可用于生物技術(shù)或生物修復(fù)的新化合物。為了促進這一發(fā)現(xiàn)，2011年6月在雅各布沙文冰川（Jakobshavn Isbrae，坐標(biāo)69.589301N, ?49.783762W）南部收集了冰川融水樣本（作為更大規(guī)模采樣計劃的一部分）。細菌在4°C、黑暗條件下于R2A瓊脂平板上進行需氧培養(yǎng)。根據(jù)菌落形態(tài)選擇并培養(yǎng)分離株。使用菌落大小、顏色、形狀、邊緣和質(zhì)地等視覺特征進行亞培養(yǎng)。將分離株儲存在-80°C的25%甘油中，并在4°C的R2A瓊脂平板上培養(yǎng)21天。單個菌落被接種到R2A肉湯（20 mL）中，在150 rpm下?lián)u床培養(yǎng)至指數(shù)期晚期。采用標(biāo)準(zhǔn)溴化十六烷基三甲基銨（CTAB）方法提取DNA。
除非另有說明，否則使用默認設(shè)置。細菌菌株GrIS 1.19、GrIS 2.15、GrIS 1.11、GrIS 2.11、GrIS 2.12和GrIS 2.14的基因組序列是在Illumina NovaSeq S4平臺上使用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量鳥槍法文庫測序的（2 × 151 bp配對末端讀取）。
文庫使用PerkinElmer Sciclone NGS機器人液體處理工作站和KAPA Biosystems HyperPrep文庫制備試劑盒（Roche）制備。使用Covaris LE220超聲儀將DNA剪切至459 bp。通過兩步固相可逆免疫沉淀（SPRI）技術(shù)（使用磁性珠子，Agencourt）對DNA片段進行大小篩選。片段經(jīng)過末端修復(fù)、加A尾處理，并與Illumina兼容的測序接頭連接。原始Illumina序列使用BBTools v38.87進行質(zhì)量過濾，并使用SPAdes（版本v3.15.3；參數(shù)設(shè)置：-phred-offset 33 –cov-cutoff auto -t 16 -m 64 –careful -k 25,55,95）進行組裝。長度小于1 kb的contigs被丟棄。
為了獲得更高質(zhì)量的大致基因組，使用SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0（Pacbio）為GrIS_2_6菌株制備文庫，并在Pacific Biosciences（PacBio）Sequel II平臺上進行測序。使用Megaruptor 3（Diagenode）將DNA剪切至約10 kb。剪切后的DNA經(jīng)過外切酶處理、DNA修復(fù)酶混合物處理和末端修復(fù)/加A尾處理，然后使用SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0（PacBio）與條形碼過表達接頭連接。文庫使用AMPure PB Beads（PacBio）純化，并使用Sequel II Binding Kit 2.0（PacBio）與Sequel II聚合酶結(jié)合。測序使用TBD樣本依賴性引物、8M v1 SMRT細胞和Version 2.0測序化學(xué)試劑，每次運行時間為1 × 900 bp。使用BBTools v38.87去除斷裂的接頭。長度大于5 kb的讀取序列使用Hierarchical Genome Assembly Process（HGAP，smrtlink/8.0.0.80529, HGAP 4 [1.0]）進行組裝。使用TensorFlow識別可能為質(zhì)粒的contigs。
CRISPR元件使用CRISPR Recognition Tool（CRT）v.1.8.2或PILER-CR程序進行鑒定。所有基因組在Integrated Microbial Genomes（IMG）數(shù)據(jù)庫中進行了注釋（≥IMG Annotation Pipeline v.5.0.23）。使用checkM v.1.2.2估計基因組完整性。通過BLAST + 2.13.0的blastn命令行工具將獲得的16S核糖體RNA基因序列與SILVA數(shù)據(jù)庫138.1進行比對，以進行分類。序列詳細信息見
表1。
表1 基因組特征總結(jié)
| 生物體 |
16S rRNA基因匹配百分比 |
原始讀取次數(shù) |
覆蓋度（×） |
完整性（%） |
污染率（%） |
Contigs數(shù)量 |
L50/N50（bp） |
大小（bp） |
GC含量（%） |
基因數(shù)量 |
C序列數(shù)量 |
P序列數(shù)量 |
| Actimicrobium sp. GrIS 1.19 [98.2] |
13,196,650 |
376.6 |
98.96 |
0.4 |
91 |
11/118,791 |
4,177,960 |
60.57 |
4,008 |
1 |
3 |
| Cryobacterium sp. GrIS_2_6 [99.6] |
291,115 |
221.7 |
98.74 |
2.15 |
2 |
1/4,227,007 |
4,344,596 |
66.70 |
4,361 |
– |
1 |
| Glaciihabitans sp. GrIS 2.15 [97.2] |
9,819,950 |
395.3 |
99.49 |
0.51 |
37 |
5/279,211 |
3,782,709 |
63.50 |
3,805 |
1 |
– |
| Oxalobacteraceae sp. GrIS 1.11 [98.9] |
13,987,370 |
276.8 |
99.55 |
1.66 |
178 |
18/106,551 |
6,495,031 |
61.20 |
6,018 |
– |
| Oxalobacteraceae sp. GrIS 2.11 [97.2] |
11,708,220 |
316.5 |
99.92 |
0.3 |
155 |
21/79,900 |
5,120,017 |
46.89 |
4,733 |
2 |
– |
| Undibacterium sp. GrIS 1.2 [98.6] |
19,293,144 |
271.1 |
100.0 |
0.69 |
99 |
7/272,887 |
5,649,109 |
63.33 |
5,650 |
– |
| Variovorax sp. GrIS 2.14 [99.0] |
19,293,144 |
271.1 |
100.0 |
0.69 |
99 |
7/272,887 |
5,649,109 |
63.33 |
5,650 |
– |
b
C表示CRISPR序列；P表示質(zhì)粒序列。
致謝
本工作得到了NASA Exobiology項目（編號80NSSC18K0814）對C.M.F.的支持，以及美國國家科學(xué)基金會（NSF）通過項目編號NSF 2037963對H.J.S.和C.M.F.的支持。K.C.還獲得了NSF NRT-2125748獎學(xué)金的資助。
我們衷心感謝M. Tedesco以及NSF 0909388項目對野外采樣工作的支持。本文中表達的任何觀點、發(fā)現(xiàn)、結(jié)論或建議僅代表作者個人觀點，不一定反映NASA或美國國家科學(xué)基金會的立場。
美國能源部聯(lián)合基因組研究所（JGI）的工作是由能源部科學(xué)辦公室資助的，合同編號為DE-AC02-05CH11231。這些數(shù)據(jù)是為JGI提案#505037生成的。
