《ACS Biomaterials Science & Engineering》：Bioactive and Injectable Granular Hydrogels Incorporating Decellularized Extracellular Matrix
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本文推薦一篇聚焦組織工程前沿的研究，其核心在于構建了一種結合去細胞化細胞外基質（dECM） 的生物活性與降冰片烯修飾的透明質酸（NorHA） 顆粒水凝膠機械穩定性優勢的新型復合體系。該體系不僅具備剪切稀化與自修復特性，可實現微創注射，還能持續釋放基質成分并促進纖維軟骨細胞（fibrochondrocytes） 的黏附與鋪展，為顳下頜關節紊亂（TMDs） 中缺乏再生能力的纖維軟骨組織（如顳下頜關節盤，TMJd）修復提供了具有潛力的新策略。
1. 引言
顳下頜關節紊亂是一種常見的肌肉骨骼疾病，在成人/老年人中發病率約為31%，且在女性中更為常見。其典型癥狀包括疼痛、關節活動受限、磨牙癥和咬合音等。作為關節的重要組成部分，顳下頜關節盤在潤滑、吸收沖擊以及減少關節表面不協調性方面發揮著關鍵作用。然而，由于其固有的再生能力有限，顳下頜關節盤容易因過度或重復受力而受損，常見的功能障礙包括變薄、穿孔和從原生位置移位。
目前，顳下頜關節盤的修復仍是一個臨床挑戰。在眾多新興的組織工程解決方案中，去細胞化細胞外基質因去除了細胞成分以降低先天免疫反應，同時保留了天然組織的許多生化特性而備受關注，成為調控細胞黏附、增殖和分化的有力候選材料。然而，盡管dECM水凝膠具有優異的生化性質，但其應用受到低機械性能和相對快速降解的限制。為了改善dECM的性能，研究人員將目光投向了顆粒系統。
顆粒水凝膠是一類通過水凝膠微顆粒（即微凝膠）堵塞而形成的可注射連續三維結構材料。與傳統塊狀水凝膠相比，它們具有微孔性，便于營養物質和氧氣的運輸，并促進細胞遷移和浸潤。此外，顆粒水凝膠還展現出剪切稀化和自愈合行為，允許以微創方式給藥。本項研究正是將TMJd來源的dECM的生物活性與基于透明質酸（HA）的顆粒水凝膠的可注射性和穩定性相結合，創造了一種旨在促進細胞黏附和局部ECM釋放的新系統。特別地，研究引入了dECM水凝膠作為二次交聯劑，利用其在37°C下的熱凝膠化特性來原位穩定結構。
2. 材料與方法
2.1. 去細胞化組織的制備與表征
研究使用來自6至8個月大的羔羊頭顱的顳下頜關節盤組織，通過結合物理（凍融循環）、化學（Triton X-100處理）和酶學（DNase/RNase處理）方法進行去細胞化。經過消毒和清洗后，材料被凍干、研磨并儲存于-20°C。對獲得的dECM進行了DNA、硫酸化糖胺聚糖（sGAG）、可溶性及總膠原蛋白的定量分析，并通過組織學染色（H&E、阿爾新藍、天狼星紅）評估了細胞去除與基質保留情況。結果表明，DNA含量顯著降低了86%，符合降低免疫原性風險的公認閾值（<50 ng/mg），同時膠原蛋白結構得以保留。
2.2. 微凝膠的生產與表征
首先合成了降冰片烯修飾的透明質酸。隨后，通過水包油乳化法制備微凝膠，將含有0.05% LAP（光引發劑）和10 mM DTT（交聯劑） 的3% NorHA前體溶液（單獨或分別與0.4%、0.8%的dECM水凝膠混合）滴加到油相中，經可見光照射交聯10分鐘形成微凝膠。研究制備了三種配方：NorHA、NorHA + dECM(0.4%)和NorHA + dECM(0.8%)。通過微吸管抽吸評估單個微凝膠的楊氏模量，并使用流變儀分析堵塞后微凝膠的剪切稀化、自愈合及粘彈性（儲存模量G′和損耗模量G″）。此外，還評估了在PBS和II型膠原酶中孵育7天內的蛋白釋放情況。
2.3. 交聯后的顆粒水凝膠構建體
為了機械穩定顆粒水凝膠，研究評估了兩種二次交聯策略：一是添加額外的LAP和DTT后，通過可見光照射進行共價交聯（稱為LAP/DTT交聯）；二是將中和后的dECM凝膠與微凝膠混合，利用其在37°C的熱凝膠化進行交聯（稱為dECM交聯）。構建體被壓縮成圓柱狀圓盤（?：4 mm， H：2 mm），并評估了其壓縮模量和孔隙率（通過FITC-葡聚糖滲透成像分析顆粒間空隙）。
2.4. 細胞研究
將半月板纖維軟骨細胞接種在顆粒構建體上，培養7天。通過固定、透化后，用Alexa Fluor 647標記的鬼筆環肽染色肌動蛋白絲，DAPI染色細胞核，并使用共聚焦顯微鏡觀察細胞形態和鋪展情況。通過ImageJ軟件分析細胞覆蓋率（鬼筆環肽染色面積與總圖像面積的比值）。
3. 結果
3.1. 去細胞化基質的評估
去細胞化方案有效移除了細胞物質，顯著減少了DNA和sGAG含量，同時保持了可溶性膠原蛋白含量，總膠原蛋白比例因其他成分的去除而相對增加。組織學圖像證實了細胞物質的完全去除、sGAG的顯著減少以及膠原纖維的保留。
3.2. 水凝膠性能
dECM成功溶解形成粘稠均勻的預凝膠溶液，在37°C下表現出熱敏性，儲存模量（G′）和損耗模量（G″）顯著增加，分別達到約80.9 ± 9.3 Pa和10.6 ± 0.2 Pa，并在約25分鐘后穩定。水凝膠表現出剪切稀化行為。凍干過程不影響其凝膠能力或機械性能。在7天內，水凝膠質量損失約7.29 ± 1.44%，并釋放出1117.50 ± 82.67 μg/mL的蛋白質，但其壓縮模量保持穩定。然而，dECM水凝膠在II型膠原酶中于24小時內完全溶解，表明其需要增強降解穩定性。
3.3. 微凝膠制備與表征
成功制備了三種配方的微凝膠，平均直徑無顯著差異（約217-224 μm）。微吸管抽吸測試顯示，隨著dECM濃度增加，微凝膠的楊氏模量顯著增加，NorHA + dECM(0.8%)組的模量最高（29.96 ± 0.51 kPa）。流變學分析表明，加入dECM后，堵塞微凝膠的儲存模量（G′）和損耗模量（G″）也相應增加，且所有配方均表現出剪切稀化和自愈合能力。在膠原酶中孵育時，含dECM的微凝膠的蛋白釋放量是PBS中的約四倍，而純NorHA微凝膠在兩種條件下均未檢測到蛋白釋放。
3.4. 顆粒水凝膠表征
兩種交聯策略均形成了多孔結構。在LAP/DTT交聯組中，加入0.8% dECM顯著降低了顆粒間孔隙率；而在dECM交聯組中則增加了孔隙率。力學測試顯示，無論采用哪種交聯策略，含有0.4% dECM的微凝膠構建體均表現出最高的壓縮模量。所有構建體在37°C PBS中孵育7天后，其壓縮模量均保持穩定。
3.5. 顆粒水凝膠的細胞相互作用
細胞實驗表明，與純NorHA相比，含有dECM的微凝膠能支持更高的細胞密度。在LAP/DTT交聯組中，0.4% dECM組在第7天顯示出廣泛的細胞球體形成，而0.8% dECM組則表現出更多的細胞鋪展。在dECM交聯組中，細胞反應更為顯著：0.4%和0.8% dECM組在第一天就顯示出更高的細胞密度，到第七天時細胞密度進一步顯著增加，尤其是0.4% dECM組，細胞形成了更相互連接的網絡。這表明dECM介導的交聯能顯著增強纖維軟骨細胞的增殖和網絡形成。
4. 討論
本研究成功地將天然（dECM）與合成（NorHA）材料的優勢相結合，利用了dECM提供的生物信號和顆粒水凝膠賦予的生物物理可控性。去細胞化過程有效去除了DNA，盡管損失了部分sGAG，但保留了膠原結構。將dECM封裝入NorHA微凝膠中，不僅提高了微凝膠的剛度，還賦予了整個顆粒系統剪切稀化與自愈合特性，使其適合于微創注射治療。同時，NorHA網絡調控了dECM的釋放動力學，減緩了其快速降解。
兩種二次交聯策略（LAP/DTT共價交聯和dECM熱交聯）在孔隙率和力學性能上表現出差異，這歸因于微凝膠的堆積行為以及dECM的加入改變了微凝膠的密度和表面性質。在細胞相容性方面，dECM的加入顯著改善了細胞的黏附和鋪展，其中dECM交聯策略，尤其是0.4% dECM配方，在促進纖維軟骨細胞形成互連網絡方面表現最佳。這可能是因為0.4%的濃度在孔隙率、中間剛度和生物信號暴露之間達到了最佳平衡，為細胞生長創造了更有利的微環境。
研究也指出了當前工作的局限性，例如細胞相互作用研究僅為期7天的初步探索，未來需要更深入地了解dECM對細胞反應的長期作用以及微凝膠的長期穩定性，并需要在特定的組織缺損模型中進行應用驗證。
5. 結論
綜上所述，本研究成功開發了一種整合了dECM的可注射顆粒水凝膠系統。該系統不僅保持了機械穩定性，具備剪切稀化和自愈合特性，還能響應酶活性控制蛋白釋放，其綜合性能超越了單獨的dECM水凝膠。兩種二次交聯方法均證明了dECM在支持細胞反應方面的有益作用，尤其是dECM介導的交聯能顯著增強纖維軟骨細胞的增殖和網絡形成，這對于纖維軟骨組織再生至關重要。未來的研究應側重于評估其在動態載荷下的長期機械性能，并使用臨床相關的顳下頜關節缺損模型在體內評估該系統的再生潛力。
