景明病毒（JMVs）是一類新出現的病毒群，最初于2010年在中國采集的微小扇頭蜱（R. microplus）中被發現。它們與節肢動物和脊椎動物均有關聯，目前因其獨特的分段基因組結構和進化上保守的蛋白質功能，被歸類為黃病毒科（Flaviviridae）正黃病毒屬（Orthoflavivirus）的暫定成員。大多數JMVs與蜱類相關，包括景明蜱病毒（JMTV）、阿龍山病毒（ALSV）、Yanggou蜱病毒、Takachi病毒和白山森林蜱病毒等，其中JMTV和ALSV已被確認與人類發熱性疾病相關。蜱源JMVs的基因組由四個單鏈正鏈RNA（ss(+)RNA）片段組成，S1和S3編碼與經典正黃病毒NS5和NS3蛋白同源的非結構蛋白（NSP1和NSP2），而S2和S4編碼的結構蛋白與已知的病毒蛋白無序列同源性。

ALSV于2017年首次在中國東北的人類和全溝硬蜱（I. persulcatus）中被鑒定，此后在歐亞大陸的節肢動物和哺乳動物（包括俄羅斯、芬蘭、法國、德國和瑞士）中均有發現，顯示出廣泛的宿主范圍和地理傳播，構成潛在的全球公共衛生威脅。該病毒已在世界范圍內的多種蜱種中被檢測到，包括全溝硬蜱、蓖子硬蜱（I. ricinus）、納氏革蜱（D. nuttalli）和嗜群血蜱（H. concinna）。研究已證實ALSV可在蓖子硬蜱和網紋革蜱（D. reticulatus）中復制。此外，通過體外飼喂實驗證實了經ALSV注射的蓖子硬蜱在吸血期間可通過唾液實現有效的病毒傳播。

在中國，ALSV主要在全溝硬蜱中被檢測到。野外研究已將全溝硬蜱確定為ALSV的潛在媒介；然而，尚未有實驗研究評估全溝硬蜱在維持和傳播ALSV方面的媒介能力。本研究通過肛門微注射將ALSV導入全溝硬蜱，旨在實驗室條件下評估該蜱種對ALSV傳播的媒介能力，為病毒的預防和控制提供新見解。

動物研究獲得了中國農業科學院長春獸醫研究所和上海獸醫研究所動物管理與倫理委員會的批準。所有涉及感染或模擬感染蜱蟲在老鼠身上飼喂的程序均在動物生物安全二級（ABSL-2）設施內的指定控制區域進行。研究遵循當地法規和機構要求。人道處理小鼠，根據體重按1000 mg/kg劑量靜脈推注氨基甲酸乙酯（100 mg/mL）進行麻醉，并通過二氧化碳過量實施安樂死。所有程序均符合中華人民共和國動物倫理程序和指南。

使用的蓖子硬蜱源細胞系（IRE/CTVM20）來自利物浦大學蜱細胞庫，在30°C下于補充了10%胰蛋白酶磷酸肉湯、20%胎牛血清（FBS）、200mM L-谷氨酰胺和1%青霉素-鏈霉素的L-15（Leibovitz）培養基中維持。

ALSV NE-TH4毒株在IRE/CTVM20細胞中繁殖。簡單來說，將IRE/CTVM20細胞接種于平側面培養管中，加入3 mL完全培養基，30°C孵育。接種四天后，通過加入100μL ALSV培養上清感染細胞，并在30°C下維持額外兩周。收集培養上清，并使用RT-qPCR（引物詳見2.5節）檢測ALSV RNA。采用蝕斑形成試驗（FFU）定量培養上清中的病毒滴度。

八周齡昆明（KM）小鼠購自遼寧長生生物技術有限公司，用作全溝硬蜱的血源。NTG（NOD-SCID IL2rg^-/-）小鼠因缺乏功能性T、B和NK細胞而免疫缺陷，購自上海杰思捷實驗動物有限公司，用于建立ALSV感染模型。所有小鼠在通風籠中適應一周，控制溫濕度條件，隨后用于實驗。

實驗室株系的全溝硬蜱在氣候室中受控條件（濕度95%，溫度25°C，12小時光暗循環）下維持。蜱蟲以KM小鼠為食以維持種群和繁殖。實驗使用前，所有蜱蟲均經過二代測序確認不含ALSV及其他潛在微生物（包括內源性病毒）。

將來自無ALSV種群的成年雌性全溝硬蜱隨機分配到感染組和對照組。感染組微注射約含100 FFU ALSV的溶液500 nL，對照組注射等體積的IRE/CTVM20細胞上清。使用IM 300顯微注射器通過肛門進行微注射。在感染后1、3、5、7和9天（d.p.i.），從ALSV注射組和模擬注射組中隨機收集五只成年蜱，作為完整個體進行病毒檢測。此外，從兩組中各隨機選擇三個生物學重復（每個重復包含五只蜱），解剖并收集唾液腺（SG）、中腸（MG）和卵巢（OV）用于ALSV RNA檢測。

使用含無菌金屬珠的TRIzol試劑在超聲破碎儀中以55 Hz處理5分鐘，勻漿蜱蟲或小鼠組織。再加入700 μL TRIzol試劑，室溫孵育10分鐘。隨后，使用自動化核酸提取試劑盒提取RNA，并遵照制造商說明使用HiScript III RT Super Mix for qPCR將RNA逆轉錄為互補DNA（cDNA）。

使用RT-qPCR檢測蜱蟲或小鼠樣本中的病毒cDNA，引物為針對ALSV S2片段的正向引物（5’- GCTTGTGGTCATCATTATG-3’）、反向引物（5’-CTCTGCCACATACTGATG-3’）和探針（FAM-CTCTCGTCAGCCATACCACCA-BHQ-1），遵循Premix Ex Taq（Probe qPCR）試劑盒的說明。熱循環程序包括95°C初始變性30秒，隨后進行50個循環：95°C變性5秒，60°C退火/延伸30秒。病毒RNA拷貝數通過十倍連續稀釋重組質粒生成的標準曲線公式確定：（拷貝數）/μL = 10^ [（Ct值 ? 39.01）/ ?2.895]。

為評估ALSV在全溝硬蜱中的經卵傳遞能力，在7 d.p.i.時，讓三只ALSV微注射蜱使用先前研究描述的模型，在八周齡雄性KM小鼠上吸血。飽血蜱個體飼養于25°C和90%濕度的受控條件下以促進產卵并確保成功孵化。產卵后30天，從每個卵塊收集三組，每組50枚卵，用于ALSV RNA檢測。剩余卵允許孵化成幼蟲，再收集三組，每組20只蜱幼蟲，用于ALSV RNA檢測。

為評估ALSV在全溝硬蜱中的經期傳遞能力，剩余的蜱幼蟲被允許在KM小鼠上吸血，每只小鼠約200只幼蟲。收集三組，每組10只飽血幼蟲，用于ALSV RNA檢測。剩余的飽血幼蟲被維持至蛻皮為若蟲，隨后收集30只若蟲（分為三組）用于ALSV RNA檢測。剩余的若蟲隨后被允許在小鼠上吸血，每只小鼠約50只若蟲；收集三只飽血若蟲個體并檢測ALSV RNA。剩余的飽血若蟲在允許蛻皮為第二代成年蜱的條件下維持兩個月，收集三只成年蜱并個體檢測ALSV RNA。

為研究ALSV從蜱蟲到小鼠的水平傳播，確認ALSV RNA陽性的成年蜱、幼蟲和若蟲吸過血的KM小鼠被實施安樂死，收集其心臟、大腦、肝臟、腎臟、肺、脾臟、睪丸和血液進行ALSV RNA檢測。

為建立ALSV病毒血癥小鼠模型，給八周齡NTG雌性小鼠腹腔接種10⁶FFU的ALSV。在3和7 d.p.i.時，每個時間點安樂死三只小鼠，收集心臟、大腦、肝臟、腎臟、肺、脾臟、腸道和睪丸以確認ALSV感染的拷貝數。為研究蜱蟲從小鼠獲取ALSV的能力，允許無ALSV的全溝硬蜱幼蟲（每只小鼠50只）和若蜱（每只小鼠15只）在3 d.p.i.時吸食ALSV感染或模擬感染的雌性小鼠（每組三只）的血液。收集飽血幼蟲（每組5只）和若蜱（每組1只飽血若蜱）并儲存于-80°C直至ALSV檢測。

使用GraphPad Prism 9.0進行統計分析。對于正態分布的數據集，通過單因素方差分析（one-way ANOVA）或雙因素方差分析（two-way ANOVA）與Tukey檢驗評估顯著性。顯著性由星號表示：*p < 0.05; p < 0.01;p <0.001;***p < 0.0001。

如流程圖所示，對微注射的完整蜱蟲及其相應組織（SG、MG和OV）進行了ALSV RNA檢測。對于ALSV注射組，病毒RNA水平顯著增加，在7 d.p.i.時達到峰值。SG、MG和OV組織中的病毒RNA隨時間呈現顯著上升趨勢，表明病毒可以在所有三種組織中復制。此外，在1、3、5、7和9 d.p.i.時，MG中的ALSV拷貝數顯著高于SG和OV。對照組未檢測到ALSV RNA。

如流程圖所示，進行了經卵傳遞和經期傳遞實驗以評估ALSV在全溝硬蜱中的垂直傳播能力。卵和孵化出的幼蟲均表現出高RNA拷貝數，范圍在10⁷至10⁸RNA拷貝/μL之間，表明蜱蟲能夠經卵傳遞ALSV。雖然在卵和幼蟲之間未檢測到RNA拷貝數的顯著差異，但幼蟲中略高的水平表明ALSV可能在幼蟲蜱中復制。在飽血幼蟲、若蟲、飽血若蟲和成年蜱中也檢測到ALSV RNA，高RNA拷貝數從10⁶到10⁹拷貝/μL不等。值得注意的是，由飽血幼蟲或若蟲蛻皮而來的若蟲和成年蜱中的病毒滴度低于蛻皮前的滴度。盡管差異不具統計學顯著性，但這表明ALSV在全溝硬蜱中的經期傳遞可能面臨某些挑戰。對照組未檢測到ALSV RNA。

感染ALSV的成年、幼蟲和若蟲蜱在雌性KM小鼠上吸食血液，飽血后被移除。被蜱蟲叮咬的小鼠被處死以收集血液和器官組織進行ALSV檢測。在不同生命階段蜱蟲叮咬的小鼠血液和組織中均可檢測到病毒RNA。值得注意的是，被成年蜱叮咬的小鼠血液和組織中的RNA拷貝數顯著低于被幼蟲或若蟲叮咬的小鼠。在被成年蜱叮咬的小鼠中，三只動物的血液和大腦中均可檢測到病毒RNA。然而，其他組織中的病毒RNA拷貝數很低且很少能檢測到。在被幼蟲或若蟲叮咬的小鼠中，在血液和幾乎所有組織中（腸道除外）均可檢測到更高滴度（10³至10⁴拷貝/μL）的病毒RNA。

在吸食了ALSV接種的雌性NTG小鼠血液后，收集飽血幼蟲、若蜱和小鼠血液/組織進行ALSV RNA檢測。在僅腹腔接種ALSV而未受幼蟲或若蜱叮咬的小鼠中，在3和7 d.p.i.時血液中均檢測到低水平的病毒RNA。在7 d.p.i.時，觀察到更廣泛的組織分布且RNA拷貝數略高。考慮到未成熟蜱蟲（幼蟲和若蟲）3至5天的吸血周期，允許蜱蟲叮咬在3 d.p.i.時發生。值得注意的是，與僅在3 d.p.i.時接受ALSV接種的小鼠相比，先接種ALSV再被無ALSV的未成熟蜱蟲叮咬的小鼠，其血液、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、腸道和睪丸組織中的病毒RNA拷貝數顯著更高。與僅在7 d.p.i.時接受ALSV接種的小鼠相比，先接種病毒再被無ALSV幼蟲叮咬的小鼠也觀察到類似的增加。被無ALSV幼蟲叮咬與若蜱叮咬的組別之間未觀察到顯著差異。在收集的飽血幼蟲和若蜱中也檢測到病毒RNA，飽血若蜱中的RNA拷貝數顯著高于飽血幼蟲。正如預期，附著在模擬感染小鼠身上的所有飽血幼蟲或若蜱的ALSV檢測均為陰性。

本研究成功證明全溝硬蜱具備對ALSV進行垂直和水平傳播的媒介能力，這與我們先前的野外調查結果一致，表明全溝硬蜱是攜帶ALSV的主要蜱種。

使用微注射方法，本研究證實成年全溝硬蜱可以獲取并維持ALSV，病毒可從雌蜱垂直傳播給其后代，并能在蜱蟲與小鼠之間水平傳播。目前，人工感染蜱蟲病毒的主要方法包括微注射和病毒懸液浸泡。浸泡法操作簡單，無需專業技術或設備，但難以準確評估初始病毒感染滴度，也難以確定蜱蟲是通過攝食還是氣門等其他途徑感染。盡管通過肛門進行微注射在技術上要求更高，但它可以精確量化病毒感染，并確認消化道是初始感染的主要部位。肛門微注射能更好地模擬自然感染，因為中腸是在自然吸血過程中最先獲取病毒的器官。

有研究報告，與低水平（10³拷貝/蜱）注射相比，高水平ALSV RNA（10⁶拷貝/蜱）微注射后，ALSV可以在蓖子硬蜱中有效復制。此外，已證實ALSV可在吸血期間通過蓖子硬蜱的唾液排出。我們的研究表明，即使微注射低病毒滴度，ALSV也能在全溝硬蜱中高效復制。ALSV微注射蜱蟲及其唾液腺、中腸和卵巢中的病毒RNA水平呈現顯著上升趨勢，表明ALSV可以在全溝硬蜱內有效復制。此外，我們的結果顯示，自1 d.p.i.以來，中腸中的病毒滴度始終高于卵巢和唾液腺，提示ALSV可能從蜱蟲的中腸傳播至唾液腺和卵巢。

盡管肛門微注射可以更準確地模擬自然感染，但過程本身與自然傳播途徑不同。在自然界中，蜱蟲通過吸食病毒血癥宿主的血液獲取病毒，而微注射則是將病毒直接引入蜱蟲。人工感染的蜱蟲可能面臨諸如未能建立穩定感染等挑戰。在此，我們首先采用人工感染來確定ALSV RNA高水平的最佳時間點，隨后利用該最佳時間點的病毒血癥小鼠來模擬自然傳播循環，從而最大程度地減少人工模擬感染對后續實驗的影響。

本研究結果表明，全溝硬蜱能夠通過垂直傳播（包括經卵傳遞和經期傳遞）傳播ALSV。卵巢、卵和孵化幼蟲中持續增加的高水平病毒滴度證實，ALSV可以有效地克服經卵傳遞屏障。蛻皮后的若蟲和成年蜱中ALSV滴度低于蛻皮前，表明ALSV克服經期傳遞屏障具有挑戰性，部分病毒在此過程中被清除。在實驗室條件下，感染蜱傳腦炎病毒的蓖子硬蜱未成熟期也觀察到同樣現象，蛻皮過程中的感染丟失可能對蜱傳病毒的基本繁殖數估計產生重要影響。這種現象可能是導致野外采集蜱蟲中蜱傳病毒感染率低的因素之一。

迄今為止，尚未成功建立ALSV的小鼠感染模型。主要原因是ALSV無法在野生型和免疫缺陷小鼠中建立高滴度、持續性的感染，且受感染動物不出現臨床癥狀或死亡。在本研究中，NTG免疫缺陷小鼠感染模型并不理想，病毒僅維持低水平的病毒血癥。然而，這足以使幼蟲和若蜱成功從血液餐中獲取ALSV。值得注意的是，與僅接種ALSV的小鼠相比，先腹腔接種ALSV再被無ALSV的未成熟蜱蟲叮咬的小鼠，其病毒RNA拷貝數顯著更高。這一發現表明，蜱蟲叮咬可能增強ALSV在小鼠體內的感染和復制。我們推測，全溝硬蜱唾液中的生物活性成分可能對此有積極作用。例如，許多蜱蟲唾液蛋白，包括絲氨酸蛋白酶抑制劑（Serpins）、Hyalomins、Japanin、Salp15、Salp20、脂質運載蛋白（Lipocalins）、金屬蛋白酶（Metalloproteases）和胱抑素（Cystatins），已被證明通過多種機制調節宿主免疫反應。更多研究應關注全溝硬蜱唾液蛋白如何促進ALSV在宿主體內的傳播。

全溝硬蜱對歐亞大陸，特別是俄羅斯、中國、日本和幾個波羅的海國家構成重大公共衛生威脅。這種蜱種宿主范圍廣泛（至少46種宿主物種），并能攜帶多種蜱傳病原體（至少51種）。有效監測傳播各種全溝硬蜱攜帶病原體的媒介能力，將有助于更深入地理解病原體傳播機制，并促進預防和控制策略的制定與實施。

總之，我們的結果表明，全溝硬蜱是ALSV的有效媒介，在實驗室條件下能夠垂直和水平傳播該病毒。我們發現，蜱蟲叮咬對小鼠體內ALSV水平的影響取決于蜱蟲的發育階段。進一步研究全溝硬蜱的生物學和生態學，以及這些蜱蟲在自然環境中病原體的動態，對于理解ALSV的公共衛生影響至關重要。