霍亂是由霍亂弧菌（Vibrio cholerae）引起的嚴重腸道傳染病。根據世界衛生組織數據，2024年全球60個國家報告了超過56萬病例和6000余例死亡。霍亂弧菌為革蘭氏陰性菌，天然存在于水生環境并通過口服途徑感染，依賴毒素共調菌毛（TCP）在小腸上皮定植。其主要毒力因子霍亂毒素（CT）由ctxA和ctxB基因編碼，位于CTXφ噬菌體上。TCP與CT的表達受ToxR/ToxS轉錄激活系統協同調控。此外，ToxR還獨立調節兩種外膜孔蛋白：激活ompU轉錄并抑制ompT。這兩種孔蛋白均與腸道定植相關。

體外研究毒力基因誘導常用AKI培養系統，其通過模擬小腸的低氧、碳酸氫鹽、pH和滲透壓等關鍵物理化學信號，有效激活霍亂弧菌的毒力調控網絡。

盡管已鑒定出200多種霍亂弧菌血清群，但只有產毒O1和O139血清群引起了流行性霍亂。近年來，中國發現了一種與第七次大流行株遺傳不同的新型O1 El Tor霍亂弧菌譜系，并與腹瀉暴發相關。本研究旨在通過比較轉錄組學和功能分析，揭示該新型譜系的毒力相關決定因素。

本研究使用的菌株包括第七次大流行株N16961（血清群O1，El Tor生物型，ctxAB⁺）、其等基因缺失突變體N16961-ΔVC1123、回補菌株N16961-ΔVC1123/cVC1123，以及來自新型譜系的兩個分離株VC6050（血清群O1，ctxAB⁺）和VC6055（血清群O1，ctxAB^-）。

為研究大流行株和新興譜系對毒力誘導條件的轉錄反應，對在AKI培養基（毒力誘導）和標準LB肉湯（對照）中培養的N16961、VC6050和VC6055進行了RNA測序。使用AKI誘導方案：細菌先在37°C靜置培養4小時至OD₆₀₀約為1.0，然后在搖動條件（200 rpm，37°C）下繼續培養6小時以誘導毒力基因表達。

使用TRIzol^?試劑從AKI和LB培養基中生長的細菌培養物中提取總RNA，并按照先前實驗流程去除基因組DNA。所有實驗均使用三個獨立的生物學重復。使用DESeq2鑒定條件間的差異表達基因（DEGs），并進行KEGG通路富集分析。

通過等位基因交換使用自殺載體pWM91在親本菌株N16961中構建了VC1123的框內缺失突變體。對于遺傳回補，將完整的VC1123開放閱讀框（ORF）克隆到載體pSRKKtc中，并電轉入N16961-ΔVC1123，產生回補菌株。

在5-6日齡C57BL/6新生乳鼠中進行定植競爭實驗。將野生型N16961與突變體或回補菌株以1:1比例混合后灌胃接種。24小時后處死小鼠，取小腸進行均質化、系列稀釋和平板計數，并計算競爭指數（CI）。還使用數字PCR（dPCR）對細菌載量進行定量。

為評估VC1123缺失是否影響膽汁鹽耐受性，將N16961和N16961-ΔVC1123在補充了不同濃度膽汁鹽的LB培養基中培養，并比較生長情況。

與LB對照相比，AKI培養在所有三個菌株中誘導了廣泛的基因表達變化：在N16961、VC6050和VC6055中分別鑒定出958、966和999個DEGs。

在N16961中，DEGs顯著富集于霍亂弧菌感染、氨基糖和核苷酸糖代謝、果糖和甘露糖代謝、糖酵解/糖異生以及生物膜形成等通路。在VC6050菌株中，DEGs主要富集于雙組分系統、細菌趨化性、核糖體、鞭毛組裝和ABC轉運蛋白等通路。對于VC6055菌株，DEGs富集主要見于雙組分系統、細菌趨化性、核糖體、嘧啶代謝和氮代謝等通路。

值得注意的是，細菌趨化性和生物膜形成通路在AKI條件下在所有三個菌株中持續下調。關鍵的趨化性基因（包括cheW、cheR、cheB、cheD、mcpH和cher2）顯示出顯著的轉錄抑制。相反，典型的毒力決定因子被上調：tcpA在所有菌株中被誘導，而霍亂毒素基因ctxAB、緊密連接毒素基因zot和輔助霍亂腸毒素基因ace在產毒菌株N16961和VC6050中特異性上調。

在AKI培養基中對三個菌株進行的成對比較揭示了廣泛的轉錄差異：N16961對VC6050有695個DEGs；N16961對VC6055有1000個DEGs；VC6050對VC6055有220個DEGs。

與N16961 AKI組相比，AKI培養的新型譜系菌株VC6050和VC6055共有342個DEGs，這些基因在雙組分系統、細菌趨化性和生物膜形成方面顯著富集。當僅比較產毒菌株（N16961和VC6050）與非產毒VC6055時，共有84個DEGs，并在鞭毛組裝和膽汁分泌通路中富集。

特別關注AKI條件下VC6050與N16961的比較，我們發現VC6050中有301個基因上調和394個基因下調。這些DEGs主要與細菌趨化性、生物膜形成和雙組分信號傳導相關。重要的是，趨化性和生物膜相關基因的下調幅度在VC6050中大于N16961。

基因VC1123在所有三個菌株（N16961、VC6050和VC6055）中高表達，基于以下幾個考慮因素被選擇進行功能表征：VC1123是霍亂弧菌中一個540-bp的開放閱讀框，編碼一個包含未知功能結構域（DUF）的蛋白；VC1123在霍亂弧菌分離株中高度保守；其在毒力誘導條件下在新譜系分離株和第七次大流行參考菌株中的持續高表達表明VC1123可能參與與宿主適應相關的核心過程。

盡管嘗試在新型譜系菌株VC6050和VC6055中構建VC1123缺失突變體未成功，但在N16961背景中成功獲得了VC1123缺失突變體（N16961-ΔVC1123）和回補菌株（N16961-ΔVC1123/cVC1123）。

在5-6日齡C57BL/6新生乳鼠中進行的競爭性感染實驗顯示，與野生型菌株相比，ΔVC1123突變體的腸道定植能力 consistently 增強了86.34倍。相比之下，回補菌株顯示出與野生型相當的定植水平，平均CI為1.06，表明VC1123負調控腸道定植。

體外生長動力學比較顯示，在有氧和厭氧條件下，突變體與野生型菌株的生長速率無顯著差異，表明定植增強并非由于肉湯培養中細菌適應性的改變。

為探索該表型的分子基礎，我們對在LB培養基中培養至對數中期（5小時）的N16961和N16961-ΔVC1123進行了RNA測序。VC1123的缺失不影響鄰近基因（VC1120–VC1125）的轉錄，表明對周圍基因的極性效應最小。差異表達分析鑒定出突變體相對于野生型有174個DEGs，其中152個上調，22個下調。KEGG通路富集顯示這些DEGs主要與群體感應、鐵載體基非核糖體肽的生物合成和生物素代謝相關。

值得注意的是，外膜蛋白基因ompU在ΔVC1123菌株中 dramatically 上調（315.6倍），而ompT下調（8.47倍）。相比之下，毒力相關調節因子toxR和toxS的表達沒有顯著變化。此外，relB和轉座酶orfAB亞基A顯著下調（分別為90.9倍和66.67倍）。

參與群體感應的基因，包括ABC轉運蛋白通透酶蛋白、ABC轉運蛋白ATP結合蛋白、肽ABC轉運蛋白通透酶蛋白和肽ABC轉運蛋白ATP結合蛋白顯著上調，平均增加2.74倍。此外，多個通過弧菌素生物合成進行鐵獲取的關鍵基因被顯著誘導。

膽汁鹽耐受性實驗表明，與N16961菌株相比，N16961-ΔVC1123在0.3%和0.5%的膽汁鹽濃度下表現出明顯的生長優勢。

RT-qPCR分析進一步驗證，在AKI培養條件下，與野生型菌株相比，VC1123缺失突變體中ompU顯著上調，而ompT顯著下調，這與LB培養基中的觀察結果一致。

為驗證RNA-seq結果，選擇了六個DEGs進行RT-qPCR分析。RT-qPCR觀察到的表達趨勢與轉錄組數據完全一致，確認了測序結果的可靠性。

本研究采用RNA-seq表征了大流行和新興霍亂弧菌譜系在毒力誘導（AKI）與非誘導（LB）條件下的轉錄反應。與AKI培養基在模擬宿主腸道環境中的作用一致，所有三個菌株均表現出主要定植因子tcpA的強烈上調。此外，典型的毒力基因ctxAB、zot和ace在兩個產毒菌株（N16961和VC6050）中被特異性誘導，證實AKI條件有效激活了核心毒力調節子。

值得注意的是，與細菌趨化性和生物膜形成相關的基因在AKI培養基中所有三個菌株中 consistently 下調。這種轉錄轉變表明細胞資源從環境持久性機制向宿主定植程序的全球重新分配——這一策略先前與細胞內環二鳥苷酸（c-di-GMP）水平降低有關。在霍亂弧菌中，磷酸二酯酶VieA降低c-di-GMP，從而抑制vps介導的生物膜形成并促進如TCP等定植因子的表達。我們的數據與此模型一致，強化了低c-di-GMP狀態有利于毒力而非環境適應的觀點。

有趣的是，產毒新型譜系菌株VC6050比經典大流行菌株N16961表現出更顯著的趨化性和生物膜相關基因抑制。我們假設這種 enhanced 下調可能反映了一種進化策略，以最大限度地減少宿主免疫檢測或噬菌體捕食。例如，減少鞭毛合成和生物膜產生可能會降低免疫原性并減少對噬菌體識別的易感性。支持這一觀點的是，我們之前的工作表明這些新譜系分離株對VP3噬菌體的敏感性降低，表明在感染過程中可能存在有利于 stealth 的共同進化適應。

基于轉錄組分析，我們確定了VC1123——一個在所有三個菌株中高表達的基因——作為毒力調節的候選因子。VC1123編碼一個包含DUF2878（PF11086）結構域的保守蛋白，并在PhrR調節子（RegPrecise）中注釋，暗示受MerR家族轉錄因子PhrR的調節。使用N16961作為親本菌株，我們構建了框內缺失突變體（N16961-ΔVC1123）和回補衍生物。新生乳鼠的競爭性定植實驗顯示，VC1123的缺失賦予腸道定植能力增強，且不改變體外有氧或厭氧條件下的生長。此外，側翼基因（VC1120–VC1125）的轉錄保持不變，排除了極性效應。這些發現共同表明VC1123作為定植的負調節因子發揮作用。

對ΔVC1123突變體的RNA-seq分析揭示了外膜孔蛋白基因的顯著失調：ompU dramatic 上調（315.6倍），而ompT下調（8.47倍），盡管toxR或toxS的表達沒有可檢測的變化。這一觀察結果尤為重要，考慮到OmpU和OmpT在霍亂弧菌發病機制中 well-established 的作用。OmpU增強對膽汁鹽和陽離子抗菌肽的抵抗力，促進對腸道上皮細胞的粘附，并促進小鼠模型中的定植。相比之下，OmpT損害膽汁耐受性并降低腸道適應性。值得注意的是，抗OmpU抗體在體外抑制細菌附著并在體內減少定植，且OmpU還能觸發腸道上皮細胞分泌IL-8，可能 shaping 宿主炎癥反應。此外，OmpU已被認為是上皮細胞內吞作用的受體，并作為霍亂毒素包裝到外膜囊泡（OMVs）中的支架，從而穩定毒素在腸道中的活性。

鑒于toxR/toxS的表達未受影響，我們的數據表明VC1123通過不依賴ToxR的途徑調節ompU/ompT。潛在的機制包括通過替代轉錄因子直接或間接調節、轉錄后控制或宿主或微生物群衍生信號的調節。例如，腸道微生物代謝物已被證明影響ompU表達和定植效率。此外，觀察到的relB下調——RelE/RelB毒素-抗毒素系統的一個組成部分——可能 contribute 于該表型，因為TA系統可以影響其他細菌中的生物膜形成和應激適應，盡管其在霍亂弧菌中的作用仍不清楚。我們假設VC1123可能作為PhrR相關調節模塊的一部分，將環境或氧化還原感應與 outer membrane 重塑聯系起來。VC1123的缺失破壞了這種調節平衡，導致OmpU和OmpT的 reciprocal 調節，從而獨立于經典ToxR/ToxS通路增強腸道適應性。

總之，我們的研究結果表明，VC1123作為一個功能未知的高度保守基因，通過可能抑制ompU和/或促進ompT（通過不依賴ToxR的機制）來充當腸道定植的抑制因子。ΔVC1123突變體毒力的增強 underscore 了在宿主感染期間微調外膜組成的重要性。未來的研究應致力于：（i）定義VC1123蛋白的分子功能，（ii）確定其調節靶點和相互作用伙伴，以及（iii）確定VC1123的表達是否受腸道中宿主或微生物線索的調節。這些見解可能揭示霍亂弧菌毒力控制的新層面，并為破壞定植的策略提供信息。

本研究有幾個局限性。VC1123的功能分析僅在N16961遺傳背景中進行，因此尚不清楚觀察到的效應是否在其他第七次大流行或新型譜系霍亂弧菌菌株中保守。此外，盡管VC1123的缺失導致ompU和ompT的 reciprocal 調節并增強腸道定植，但我們尚未直接證明孔蛋白失衡是定植表型的因果驅動因素。未來使用多種菌株背景和靶向遺傳上位性分析的研究將 required 以確定VC1123功能的普遍性，并 definitively 將OmpU/OmpT失調與腸道適應性聯系起來。