套索肽是一類具有獨特拓撲結構的核糖體合成與翻譯后修飾肽（RiPPs）。其結構特征是形成一個N端大內酰胺環，將C端尾部“套”在其中，形成一種類似于輪烷的機械互鎖拓撲。這種獨特構象賦予了套索肽出色的熱穩定性和抗蛋白酶降解能力。憑借如此堅固的結構骨架以及其多樣的生物活性（包括抗菌、抗病毒和受體拮抗特性），套索肽已成為天然產物發現和生物工程研究的有力候選者。值得注意的是，套索肽的生物合成機器非常精簡，然而，由于其核心肽區域的序列高度可變性，它們涵蓋了廣闊的化學空間。

在通過基因組挖掘發現的套索肽家族中，citrulassins構成了一個特別有趣的亞群。這類肽的標志性特征是一個由精氨酸經肽酰基精氨酸脫亞胺酶（PAD）催化脫亞胺化產生的、罕見的瓜氨酸殘基。瓜氨酸化在細菌天然產物中極為罕見，在citrulassin A被發現之前，在RiPPs中也前所未有。引人注目的是，負責此修飾的PAD并不編碼在經典的套索肽生物合成基因簇（BGC）內，而是位于基因組的其他位置，揭示了一種功能必需的修飾酶在遺傳上與核心途徑相分離的不尋常生物合成邏輯。這種非典型的基因組排列提出了關于途徑組織、酶募集和RiPP生物合成系統隱藏化學潛力的基本問題。

傳統的活性導向篩選方法長期受到化合物重復發現率高的問題困擾。相比之下，基因組挖掘已成為后基因組時代的一種有力策略，能夠系統地識別生物合成基因簇并靶向發現新型天然產物。然而，識別攜帶稀有和非經典修飾（尤其是那些由編碼在核心BGC之外的酶催化的修飾）的RiPPs，使用單探針或基于基序的基因組挖掘策略仍然具有挑戰性。

本研究采用了一種雙探針基因組挖掘策略，旨在選擇性識別攜帶瓜氨酸修飾的citrulassin型套索肽。首先，以citrulassin A生物合成途徑中的套索肽環化酶基因（citC）作為初始探針，篩選IFB細菌基因組數據庫，識別出多個候選套索肽BGCs。隨后，使用RiPPMiner平臺對相應的核心肽進行注釋和分類。為了進一步富集瓜氨酸修飾的候選物，使用一個已確認的PAD酶（WP_064069847.1）作為第二個探針進行同源性搜索，從而優先篩選出同時擁有套索肽合成機制和推定PAD同源物的菌株。在此策略指導下，通過發酵和靶向分離，發現了一種先前未被表征的瓜氨酸修飾套索肽——citrulassin N。

采用兩步靶向基因組挖掘策略從IFB細菌基因組數據庫中識別潛在的citrulassin生產菌株。第一輪，以citrulassin A生物合成基因簇（BGC）中的套索肽環化酶基因citC作為BLASTP查詢序列，設定>45%的序列同一性閾值。此搜索得到了分布在34個不同細菌菌株中的34個推定套索肽BGCs。為了評估這些BGC是否編碼citrulassin型前體肽，使用RiPPMiner平臺分析了相應的前體肽。值得注意的是，所有預測的核心肽在第9位共享一個保守的精氨酸殘基，該位置對應套索拓撲結構中緊鄰大內酰胺環外的第一個氨基酸。這種位置保守性是citrulassin型套索肽的定義性特征，因為該精氨酸殘基是翻譯后瓜氨酸化的底物。在第二輪篩選中，使用一個已確認的肽酰基精氨酸脫亞胺酶（PAD）同源物（WP_064069847.1）作為次要探針，對34個第一輪陽性菌株進行BLASTP分析。該分析鑒定出15個菌株同時擁有一個citrulassin樣套索肽BGC和一個簇外PAD同源物。保守的含Arg9前體與推定PAD酶的共存，強烈暗示了產生瓜氨酸修飾套索肽的生物合成潛力，從而顯著縮小了候選生產者的范圍。

通過雙探針基因組挖掘識別出的15個候選菌株進行了發酵，隨后使用液相色譜-質譜聯用（LC-MS）進行代謝物分析。在這些菌株中，Streptomycessp. NAX00255在m/z820.9511處顯示出一個顯著的分子離子峰，對應[M+2H]²⁺，這與基于RiPPMiner分析預測的瓜氨酸修飾套索肽分子量高度匹配。受此結果鼓舞，對Streptomycessp. NAX00255進行了大規模發酵以利于化合物分離。隨后結合ODS中壓液相色譜（MPLC）和半制備反相高效液相色譜（RP-HPLC）進行純化，得到了10 mg目標化合物，命名為citrulassin N。

Citrulassin N被分離為白色無定形粉末。高分辨電噴霧電離質譜（HR-ESI-MS）根據觀察到的[M+2H]²⁺離子在m/z820.9511，確定其分子式為C₇₀H₁₂₁N₂₁O₂₄。綜合一維（¹H, ¹³C）和二維（¹H-¹H COSY, HSQC, HMBC）核磁共振譜分析，揭示化合物包含15個氨基酸殘基。考慮到20個羰基信號占據了21個不飽和度中的20個，我們推斷該肽中存在一個額外的環狀結構，這與預測的套索肽環狀結構一致。LC-MS/MS碎裂數據明確建立了C端七肽（Cit9-Leu10-Ile11-Leu12-Ser13-Lys14-Asn15）的序列，并證實了由八殘基片段（Leu1-Leu2-Gln3-Ser4-Ser5-Gly6-Asn7-Asp8）形成的大內酰胺環的存在。這些結果確鑿地證明了化合物的平面結構是由一個八元大內酰胺環連接一個七殘基C端尾部構成，從而將其結構定義為套索肽。

基于對Streptomycessp. NAX00255的基因組分析以及citrulassins的保守生物合成邏輯，提出了citrulassin N的合理生物合成途徑。套索肽BGC內編碼的前體肽由一個前導肽和一個15殘基的核心肽組成。生物合成始于前導肽被前導肽酶蛋白水解切割，釋放出成熟的核心肽。隨后，套索肽環化酶催化Leu1的α-氨基與Asp8的側鏈羧酸鹽之間形成酰胺鍵，從而形成八元N端大內酰胺環，這是構建套索拓撲的關鍵步驟。值得注意的是，前體核心肽中的第九個殘基是精氨酸，它位于大內酰胺環外，是瓜氨酸化的底物。Arg9脫亞胺化為瓜氨酸被認為是由一個簇外PAD同源物催化，從而產生了定義citrulassin N的標志性瓜氨酸修飾。最后，C端尾部穿過大內酰胺環，形成機械互鎖的套索結構。該生物合成途徑與citrulassin A的途徑高度相似，強調了保守的citrulassin型套索肽BGC與簇外PAD基因的組合足以指導瓜氨酸修飾套索肽的生物合成。

鑒于已報道的多種套索肽均表現出抗菌活性，評估了citrulassin N對一組革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抗菌潛力。結果表明，該化合物僅對金黃色葡萄球菌ATCC 6538表現出微弱的抑制活性，最低抑菌濃度（MIC）為40 μg/ml，而對其他測試菌株未顯示出顯著活性。

本研究通過整合兩個互補的遺傳標記的靶向基因組挖掘策略，鑒定并結構表征了一種新的瓜氨酸修飾套索肽citrulassin N。通過結合一個保守的核心生物合成酶（套索肽環化酶，CitC）和一個功能診斷性的修飾酶（肽酰基精氨酸脫亞胺酶，PAD），我們能夠有效地優先篩選出真正具有生產citrulassin型肽潛力的候選菌株。這種雙探針策略顯著減少了需要實驗驗證的候選生物合成基因簇數量，并最終促成了這種先前未報道的瓜氨酸修飾套索肽的發現。

Citrulassins的一個定義性特征是通過PAD催化的精氨酸脫亞胺化產生一個瓜氨酸殘基，這是一種在細菌天然產物中極為罕見的翻譯后修飾。值得注意的是，負責此轉化的PAD編碼在經典的套索肽生物合成基因簇之外。Citrulassin N的成功鑒定強化了以下觀點：遺傳上不相關的修飾酶可以在RiPP生物合成中發揮重要作用，并且它們在基因組中的存在可以作為特定化學修飾的可靠指標。我們的結果進一步表明，位于大內酰胺環外的保守Arg殘基代表了瓜氨酸化的特權位點，強調了套索肽拓撲結構與翻譯后修飾之間的緊密相互作用。

基因組分析預測的結構與通過核磁共振和質譜實驗確定的結構高度一致，凸顯了RiPPMiner等生物信息學工具在指導RiPP發現方面日益增長的可靠性。盡管citrulassin N僅顯示出微弱的抗菌活性，但其發現仍然意義重大。這項工作主要不是擴展生物活性空間，而是通過闡明如何定制基因組挖掘策略以選擇性發現攜帶稀有且化學特性鮮明的修飾的RiPPs，從而提升了方法學能力。

更廣泛地說，本文展示的雙探針基因組挖掘概念很容易擴展到其他RiPP家族。將核心生物合成基因與特征性修飾酶（特別是那些負責不常見或機制有趣的修飾的酶）配對，提供了一種可推廣的策略，用于獲取可能被傳統單探針或基于基序的搜索所忽略的隱藏化學多樣性。隨著基因組數據庫的不斷擴展，這種聚焦且由邏輯驅動的挖掘方法對于高效發現結構和生物合成上不尋常的天然產物將變得越來越有價值。

總之，我們報道了通過整合套索肽環化酶和簇外肽酰基精氨酸脫亞胺酶的雙探針基因組挖掘策略，發現了新的瓜氨酸修飾套索肽citrulassin N。全面的結構解析證實了套索拓撲結構以及基因組分析預測的位點特異性瓜氨酸修飾。這項工作擴展了citrulassin家族，并證明基于生物合成邏輯的靶向遺傳篩選可以顯著簡化對攜帶稀有翻譯后修飾的RiPPs的發現過程。