雞傳染性支氣管炎（IB）是由雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）引起的一種急性、高度傳染性病毒性疾病。自1930年在美國首次爆發(fā)并于1950年代傳入中國以來，IBV已成為威脅養(yǎng)禽業(yè)的主要病原體。IBV屬于γ-冠狀病毒屬，其基因組為單股正鏈RNA，長度約27.6 kb。病毒的結(jié)構(gòu)蛋白包括刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）。其中，S蛋白在宿主細胞內(nèi)被蛋白酶切割為N端的S1亞基和C端的S2亞基。S1亞基包含主要的受體結(jié)合域（RBD），負責細胞附著，是主要的保護性抗原；而S2亞基則介導病毒包膜與宿主細胞膜的融合。

在中國，IBV目前以多種基因型的復雜混合物形式流行。基于S1基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，已鑒定出9種基因型（GI–GIX），其中GI型單獨包含42個不同的譜系。在這些譜系中，QX型（GI-19）在中國占主導地位，而4/91型（GI-13）自1991年在歐洲首次出現(xiàn)后已傳播至全球。值得注意的是，4/91型毒株顯示出廣泛的重組潛力，容易與QX型毒株交換遺傳片段，進一步使流行病學情況復雜化。目前，IB主要通過接種減毒活疫苗或滅活疫苗來控制。然而，IBV的高突變率和毒株間重組的傾向顯著降低了抗原性不同的血清型或基因型毒株之間的交叉保護效力。因此，當前的疫苗無法對流行的野毒株提供強有力的免疫保護，從而促進了病毒逃逸并使疾病控制復雜化。

為了深入了解中國東部和南部地區(qū)IBV的分子流行病學，研究團隊在2024年5月至2025年2月期間進行了一項監(jiān)測計劃。從四個省份（江蘇、安徽、山東和廣東）的商業(yè)黃雞群中分離出49株IBV野毒株，這些雞群均接種過H120、4/91或QXL87疫苗。通過對完整S1基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，所有分離株均歸屬于GI-19（QX型）或GI-13（4/91型）譜系。值得注意的是，QX型分離株與QXL87疫苗株（S1氨基酸同源性93.4%–99.8%）表現(xiàn)出顯著的遺傳差異，并形成了幾個主要的進化支，由四個毒株代表：CK/CH/XZ/240457（XZ240457）、CK/CH/CZ/240601（CZ240601）、CK/CH/WF/24054（WF24054）和CK/CH/WF/526（WF526）。這種抗原漂移可能是當前疫苗保護效果不理想的關(guān)鍵因素。針對S1區(qū)域的重組分析鑒定出三個源自QX型和4/91型親本毒株的分離株。在1日齡無特定病原體（SPF）雞中對四個代表性QX型分離株和重組株AH240519（以QXL87為主要親本）進行的毒力測試，導致了不同程度的死亡率以及呼吸系統(tǒng)和腎臟組織的特征性組織病理學損傷。

研究使用了由濟南斯艾斯家禽有限公司提供的SPF雞胚和1日齡SPF雞。在2024年5月至2025年2月期間，從出現(xiàn)呼吸道癥狀（如咳嗽、喘息、啰音和流鼻涕）的病弱雞中采集了540份口咽和泄殖腔拭子。樣本來自中國四個省份的雞群，所有雞群均接種了由QYH生物科技有限公司提供的減毒活疫苗H120（FJ888351）、4/91（KF377577）或QXL87（MH743141）。病毒分離通過將樣本在-80°C凍融三次，離心取上清，然后在9日齡SPF雞胚尿囊腔中進行三代盲傳。使用RT-qPCR鑒定病毒陽性。通過RT-PCR擴增IBV的S1基因并進行測序，使用MEGA（11.0版）進行多序列比對，并基于鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用RDP4（Recombination Detection Program 4）軟件進行重組分析，并通過SimPlot（3.5.1版）進行相似性繪圖分析驗證。通過將病毒接種9日齡SPF雞胚并測定EID₅₀來評估病毒滴度，并通過RT-qPCR測定不同時間點的病毒RNA拷貝數(shù)以繪制生長曲線。選擇五個S1氨基酸與QXL87疫苗株差異超過5%且屬于不同主要系統(tǒng)發(fā)育支系的毒株（包括四個GI-19毒株和一個重組株AH240519）進行毒力測試。將120只1日齡SPF雞隨機分為6組，每組20只，感染組通過眼鼻途徑接種10^5.0EID₅₀的病毒，對照組接種PBS。連續(xù)14天監(jiān)測臨床癥狀和死亡率，并在感染后特定時間點收集組織樣本用于組織病理學檢查和病毒載量測定。病毒交叉中和試驗使用抗QXL87血清進行，計算交叉中和R值以評估抗原相關(guān)性。使用ESPript 3.0進行S1氨基酸序列比對，并基于M41刺突蛋白冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（PDB: 6CV0）通過SWISS-MODEL進行同源建模，使用PyMOL（v2.5.4）評估突變殘基的結(jié)構(gòu)影響。數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism（7.0版）進行統(tǒng)計分析。

在2024年至2025年間，540份樣本中有168份RT-qPCR檢測為陽性，陽性率為31.11%。共從四個中國省份成功分離出49株IBV：江蘇（n=12，24.49%）、安徽（n=22，44.90%）、山東（n=13，26.53%）和廣東（n=2，4.08%）。所有分離株均歸類為GI基因型，主要為GI-19（n=40，81.63%），其次是GI-13（n=6，12.24%）以及GI-19和GI-13的重組株（n=3，6.12%）。

S1氨基酸序列比對顯示，分離株之間以及分離株與疫苗株之間均存在顯著差異。GI-19分離株與QXL87的S1氨基酸同源性在93.4%到99.8%之間，而GI-13分離株與4/91疫苗株的同源性較高，在98.9%到99.1%之間。五個與QXL87進化距離較遠的分離株（AH240519、XZ240457、CZ240601、WF24054和WF526）與QXL87的S1氨基酸同源性分別為89.4%、93.9%、95.0%、93.3%和93.9%。

使用RDP4軟件對S1基因進行重組分析，鑒定出三個分離株（AH240519、CZ240536和WF2407）的S1基因存在重組事件。AH240519是由QXL87（主要親本）和4/91重組產(chǎn)生的；而CZ240536和WF2407則以4/91為骨架（主要親本），QXL87提供了離散的內(nèi)部區(qū)域。這些重組事件顯著增加了IBV的遺傳多樣性，并突顯了S1區(qū)域的模塊化進化。

選擇四個QX型分離株和重組株AH240519進行生物學特性研究。所有毒株均能在SPF雞胚中引起嚴重的發(fā)育遲緩和矮小化病變。生長動力學分析顯示，重組株AH240519在感染后24小時的病毒滴度顯著高于其他四個分離株，表明與4/91的重組可能賦予其短期復制優(yōu)勢。而WF526在所有時間點的病毒載量均最低，提示其毒力可能減弱。

在1日齡SPF雞中評估五個分離株的毒力。結(jié)果顯示，毒力譜存在明顯差異。感染AH240519和XZ240457的雞出現(xiàn)嚴重的呼吸道癥狀，死亡率分別為40%和50%。感染CZ240601或WF24054導致較輕的疾病，死亡率為20%。而WF526僅引起短暫、輕微的臨床癥狀，存活率為100%。口咽和泄殖腔的病毒排毒在所有攻毒組（除WF526在3天時外）的3、6、9和14天均持續(xù)較高。氣管、肺和腎臟組織的病毒載量在感染后6-9天達到峰值，隨后逐漸下降，但到14天時仍可檢測到病毒RNA。AH240519和XZ240457在這些組織中的病毒基因組拷貝數(shù)顯著高于其他組，證實了它們對呼吸道和泌尿道的顯著嗜性以及與其較高毒力相對應(yīng)的持續(xù)病毒排毒。

感染后6天的剖檢觀察顯示，除WF526攻毒組外，所有病毒感染組均出現(xiàn)明顯的病變。感染AH240519、XZ240457、CZ240601和WF24054的雞氣管出現(xiàn)廣泛的黏膜下出血并伴有大量黏液性滲出物。WF526僅引起輕微的分泌物。所有感染組的肺部病理均較嚴重，有明顯的充血和水腫，但AH240519和XZ240457還表現(xiàn)出廣泛的肺壞死。除WF526外，所有組的腎臟病變均表現(xiàn)為典型的“花斑腎”表型——腎臟腫大伴多灶性白色尿酸鹽沉積。組織病理學分析進一步證實了這些差異。氣管組織顯示明顯的黏膜增厚、廣泛的上皮脫落以及異嗜細胞和單核細胞密集浸潤。肺組織表現(xiàn)出明顯的毛細血管充血、多灶性出血、間隔增厚和顯著的炎癥細胞浸潤。腎組織以腎小球萎縮、廣泛的腎小管上皮壞死和間質(zhì)內(nèi)明顯的炎癥浸潤為特征。相比之下，WF526組的組織僅顯示最小病變，組織結(jié)構(gòu)基本完好，炎癥細胞浸潤極少，沒有廣泛的上皮損傷或壞死證據(jù)。

交叉中和試驗評估了分離株與QXL87疫苗株之間的抗原相關(guān)性。所有五個毒株與QXL87的交叉中和R值均超過11%，表明它們與QXL87屬于同一血清型，但中和能力存在差異。CZ240601和WF526的R值分別為44.75%和33.98%，表明存在較小的亞型差異。相比之下，AH240519、XZ24057和WF24054則觀察到主要的亞型差異，R值分別為13.32%、23.71%和21.50%。AH240519與QXL87的R值最低，表明重組事件可能通過降低S1基因同源性使病毒能夠逃避QXL87的中和作用。

對四個QX型分離株、一個重組株和QXL87疫苗株的S1氨基酸序列進行多序列比對，揭示了導致近期抗原漂移的獨特氨基酸替換。在流行QX病毒中保守但與QXL87不同的八個殘基位于S1亞基的N端結(jié)構(gòu)域（NTD）或C端結(jié)構(gòu)域（CTD）內(nèi)。將五個位于溶劑可及表面的替換（Thr125Ile、Thr143Ser、Leu167Phe、Asp337Glu和Arg369Lys）投射到以M41刺突蛋白為模板構(gòu)建的QXL87 S1三聚體同源模型上。結(jié)構(gòu)建模顯示，每個替換都擾亂了局部結(jié)構(gòu)。

自20世紀80年代在中國出現(xiàn)以來，IB已成為威脅養(yǎng)禽業(yè)的最重要疾病之一。盡管廣泛使用多種疫苗來控制其傳播，但不同IB毒株的爆發(fā)仍頻繁被報道。本研究中，盡管常規(guī)免疫使用了減毒活疫苗H120、4/91或QXL87，但在2024年5月至2025年2月期間仍從中國東部和南部的商業(yè)黃雞群中分離出49株IBV野毒株。與疫苗接種雞群中反復出現(xiàn)的QX型爆發(fā)一致，GI-13野毒株與4/91疫苗株的差異極小，而GI-19分離株與QXL87的相似性顯著降低，其范圍超過了通常認為指示血清型轉(zhuǎn)變的5%閾值。這種抗原漂移可能是當前疫苗保護不完全的潛在原因。

相應(yīng)地，研究重點分析了QX型分離株的基因組和表型特征。S1基因的系統(tǒng)發(fā)育分析揭示了40個QX型分離株和重組株AH240519之間存在顯著的異質(zhì)性，它們分化為五個不同的譜系。攻毒實驗揭示了五個系統(tǒng)發(fā)育上不同的QX型分離株之間存在明顯的毒力異質(zhì)性。先前的研究表明，QXL87和4/91之間的重組可能導致高致病性毒株的出現(xiàn)。重組株AH240519引起了40%的死亡率，這與毒性最強的親本QX毒株的死亡率在統(tǒng)計學上無差異。這一發(fā)現(xiàn)表明，重組可以在改變抗原性的同時保持甚至增強毒力。這些數(shù)據(jù)加深了人們的擔憂，即同時使用多種活疫苗可能會無意中加速新型重組株的產(chǎn)生。

為了闡明此類強毒重組株的出現(xiàn)，研究其潛在的分子機制至關(guān)重要。重組是冠狀病毒復制的重要組成部分，對于產(chǎn)生亞基因組RNA（sgRNA）至關(guān)重要，并且與新毒株的出現(xiàn)密切相關(guān)。IBV易出錯的RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp）在sgRNA合成過程中頻繁切換模板，產(chǎn)生嵌合中間體和鑲嵌基因組。AH240519、WF2407和CZ240536毒株都是4/91和QXL87疫苗株在S1基因內(nèi)同源重組的結(jié)果。S1亞基占據(jù)了刺突糖蛋白的N端一半，含有主要的病毒中和表位，是疫苗誘導的保護性抗體的主要靶標。然而，由于S1亞基是疫苗誘導中和抗體的主要靶標，它受到強烈的免疫選擇壓力，在這種壓力下，病毒傾向于通過突變或重組來逃避疫苗接種賦予的免疫力。

在中國同時使用4/91和QX活疫苗，會產(chǎn)生一個21-28天的時期，期間疫苗病毒排毒與野毒株共感染重疊。4/91的S1結(jié)構(gòu)域主要靶向上呼吸道上皮，而QX的S1結(jié)構(gòu)域則引導病毒在腎小管中復制。融合了這些決定因素的重組事件使子代病毒能夠利用兩種進入途徑，從而擴大組織嗜性，增加累積病毒載量，延長排毒時間，并增強后續(xù)傳播。與因適應(yīng)性成本而迅速減弱的點突變體不同，這些S1重組體獲得了多個中和表位和雙重嗜性，而沒有額外的適應(yīng)性代價，并且可以在農(nóng)場內(nèi)持續(xù)流行多年。

為了評估流行分離株與QXL87疫苗株之間的抗原相關(guān)性，進行了交叉中和試驗。盡管所有分離株的R值均高于11%，表明不存在明確的血清型轉(zhuǎn)變，但觀察到對QXL87的交叉中和活性有不同程度的降低。總的來說，流行分離株之間的這些抗原差異可部分歸因于S1亞基內(nèi)的漸進性分化。鑒于S1氨基酸序列同源性與交叉中和R值之間存在正相關(guān)，這種分化可能導致QXL87疫苗對當前野毒株的保護效力降低。然而，對分離株的抗原分析進一步表明，抗原變異不能僅由S1氨基酸同一性決定，因為某些關(guān)鍵殘基可能對抗原相關(guān)性產(chǎn)生關(guān)鍵影響。對五個分離株的結(jié)構(gòu)分析進一步確定了S1亞基內(nèi)的幾個氨基酸替換。先前的研究報告稱，HVR（高變區(qū)）內(nèi)異質(zhì)性的增加與抗原相似性的降低有關(guān)。在本研究中，關(guān)鍵替換（包括Thr125Ile、Thr143Ser、Leu167Phe、Asp337Glu和Arg369Lys）位于溶劑可及表面，可引起局部構(gòu)象變化，從而削弱抗體結(jié)合并降低抗原性。這些替換共同重塑了關(guān)鍵的中和表位，并重新定義了S1亞基的抗原格局。積累的分化減少了與QXL87疫苗株的抗原重疊，促進了免疫逃逸，并促成了最近的QX型爆發(fā)。

綜合證據(jù)表明，應(yīng)更新疫苗配方，以包含本研究中鑒定的主要進化支的代表性抗原。持續(xù)的基因組和抗原監(jiān)測對于檢測抗原漂移和指導迭代疫苗重新配制至關(guān)重要。